Si對NaCl脅迫下金絲小棗葉片中礦質(zhì)元素微域分布的影響

摘要：為進一步揭示硅(si)與金絲小棗(Zizphus jujuba Mill.cv.Jinsixiaozao)耐鹽性的關系，以金絲小棗品種2a生嫁接苗為試材，研究了NaCl脅迫下si對其葉片中礦質(zhì)元素相對含量的影響。X-射線能譜分析結(jié)果表明，與對照相比，鹽脅迫下金絲小棗葉片各個組織的細胞中K、Na元素相對含量均顯著升高，Cl元素相對含量小幅升高，si、Ca、Mg元素相對含量在大多數(shù)組織的細胞中顯著下降；K、Ca、Si元素與Na、cl元素相對含量間的比值明顯改變，其中K／Na在柵欄組織的細胞中顯著下降，ca／Na和si／Na幾乎在所有組織的細胞中均顯著下降。與鹽脅迫相比。鹽脅迫下加Si，棗葉片大多數(shù)組織的細胞中Ca元素相對含量升高不明顯，P元素相對含量變化很小，Mg元素相對含量持續(xù)降低，但Na、cl、K、si元素相對含量在棗葉細胞中均顯著變化，其中在葉綠體主要分布的柵欄細胞巾K元素相對含量升高的幅度與Na、CI元素相對含量降低的幅度均超過28.0％，Si元素相對含量在除下表皮細胞以外的所有葉細胞中均成倍升高，同時，這幾種元素相對含量間的比值也顯著改變，尤以K／Na、Si／Na和si／Cl顯著增大最為突出。結(jié)果說明，Si影響鹽脅迫下金絲小棗對礦質(zhì)元素的選擇性吸收與分配，改善鹽脅迫下金絲小棗葉片中鹽分離子的平衡及微域分布。

關鍵詞：金絲小棗；NaCl脅迫；Si；微域分布；x一射線能譜

中圖分類號：S665.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2010)03-355-08

作為綠色植物進行蒸騰和光合作用的主要器官，葉的生理狀況對植物水分吸收、礦質(zhì)運輸、經(jīng)濟產(chǎn)量、環(huán)境適應等有重要影響。前人的研究業(yè)已表明，鹽分離子在葉中的積累與毒害作用是鹽脅迫造成植物傷害的主要原因；鹽脅迫下加硅(Si)可降低鹽分離子在一些植物葉中的積累而緩解鹽脅迫，但鹽脅迫下加Si與否對鹽分離子在葉中微域分布的影響及其與植物耐鹽性的關系鮮有報道。金絲小棗(Ziz咖bus Jujube Mill.cv.Jinsixiaozao)是著名棗優(yōu)良品種，栽培面積與產(chǎn)量在中國棗樹中均居第一位，在棗產(chǎn)品國際貿(mào)易中所占比重也很高。由于主產(chǎn)區(qū)鹽漬化土地廣布，鹽脅迫在危害金絲小棗生長發(fā)育和經(jīng)濟產(chǎn)量的逆境中影響最大。作者此前的試驗表明，鹽脅迫下提高栽培基質(zhì)中可溶性Si含量可促進金絲小棗生長，改善其葉片葉綠素熒光參數(shù)和氣體交換狀況。并對其根尖各組織細胞中的離子分布、根尖和葉片細胞膜膜脂流動性、脂肪酸組成及多胺狀態(tài)等產(chǎn)生作用。我們以2a生金絲小棗苗為試材，研究了鹽(NaCl)脅迫下加Si對其葉片中K、Na、C1、Ca等8種礦元素微域分布的影響，以期從一個方面揭示Si營養(yǎng)與這一棗品種耐鹽性的關系。迄今，在棗樹栽培生理研究方面，尚未見有報道。

1 材料和方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

農(nóng)耕土加5％(W／W，下同)草炭和10％河沙，拍碎、混勻、過篩后作為盆土。盆土含有機質(zhì)1.352％速效氮(N)0.0049％，速效磷(P)0.0025％，速效鉀(K)0.0148％，pH7.22。栽植用塑料(PVC)盆，高25cm，上口直徑30cm，下口直徑25cm，底部具排水孔，置于淺壁托盤上。每盆裝配制好的盆土6.50kg(干質(zhì)量，DW)。棗苗為2a生金絲小棗，酸棗(Z.spinosa(Bunge)Hu)砧木，于3月10日定植，定干高度50cm，接蠟封口。栽植后，每盆追施0.025％CO(NH₂)₂0.015％Ca(H₂PO₂)₂·H₂O和0.020％K₂SO₄。

試驗在塑料溫室中進行，避雨，自然光照。設鹽脅迫下不加硅(NaCl，加0.30％NaCl、不加Si)和鹽脅迫下加硅(NaCI+Si，加0.30％NaCl，加0.040％Si)2種處理，對照(Contro1)為不加NaCI和Sj。Si源為K₂SiO₃·nH₂O(化學純)，加Si處理中由K₂SiO₃·nH₂O所引入的K’量從K2S04中扣減，因此而減少的S04₄²用稀H₂SO₄補償。每處理5-7株。盆中追施的3種肥料及加入的NaCl、K₂SiO₃·nH₂O均一次稱好，對水至4000mL，栽植后分4次均勻澆人，于3月31日完成，處理日數(shù)從4月1日算起。澆灌所用水源為自來水。灌溉時偶爾有滲漏到栽植容器(PVC盆)下的托盤中的溶液，于1h內(nèi)返澆人盆。此后，每隔3～5d每盆澆等量自來水1次，每次每盆1.5×10²mL～2.0×10³mL，保持盆中土壤濕度為田間持水量的75％～80％。至9月中旬，棗樹植株從盆中取出后立即取樣，處理日數(shù)為165d。

1.2 葉片中礦質(zhì)元素分布的X-射線能譜微域分析

從各處理中選擇株高、冠幅、葉量、葉色具代表性的植株1～2株，取樹冠中部外圍棗吊上的葉片，用鋒利刀片切割葉片主脈基部的部分作為葉樣，錫箔包裹后投入液氮中速凍，冷凍真空干燥，在LEO1530型場掃描電子顯微鏡下觀察，8型X-射線能譜儀，最大加速電壓15.00keV，樣品傾斜角0°，樣品與探針間的角度為35°，附帶標樣程序計算機判斷各峰值代表的元素種類，并自動計算出峰譜中K、Na、Mg、Si、P、S、Cl、Ca等8種元素分別占細胞中這些元素總重量的百分數(shù)。按棗葉的解剖學結(jié)構特點，所分析的微區(qū)為上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織、木質(zhì)部、韌皮部以及薄壁組織的細胞(圖1)。每處理3次重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS10.0(the Statistical Package for So-cial Science for Windows 10.0)作統(tǒng)汁分析。各處理間的差異顯著性均作多重比較(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Si對鹽脅迫下金絲小棗葉片細胞中礦質(zhì)元素相對含量的影響

圖2是鹽脅迫(a)及鹽脅迫下加Si(b)金絲小棗葉片橫切面上K、Na、Cl、Ca等8種礦質(zhì)元素X-射線能譜圖(各1個樣品)。由圖2可見，加速電壓≤5.00 keV，2種處理的棗葉X-射線能譜圖雖然在各個組織的細胞中不完全相同，但基本上呈現(xiàn)為2種類型，差異明顯。總體上，與鹽脅迫相比，鹽脅迫下加Si棗葉Na峰、Cl峰顯著降低，Mg峰降低比較明顯，

K峰、Ca峰則顯著升高。

表1是對照、鹽脅迫及鹽脅迫下加Si的金絲小棗葉片不同組織的細胞中8種元素的相對含量分析結(jié)果。由表1可見，鹽脅迫下金絲小棗葉片各組織的細胞中礦質(zhì)元素含量水平發(fā)生重大變化：(1)棗葉各組織的細胞中Na元素相對含量均較對照顯著升高，在上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中增幅分別達110.0％、390.7％、182.6％、98.4％、178.9％、51.7％及114.9％。(2)Cl元素相對含量除在上表皮細胞中降低25.2％外，在棗葉其余各組織的細胞中均表現(xiàn)為升高，只是增幅小于Na元素，在下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中增幅依次為201.5％、33.8％、25.1％、9.7％、53.6％及19.3％，其中在下表皮和韌皮部細胞中顯著高于對照。(3)原來高居第1位的Ca元素，鹽脅迫下其相對含量均表現(xiàn)為下降，在上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中降低幅度分別為13.7％、51.8％、43.2％、24.0％、46.7％、49.4％及43.3％，其中：除在上表皮細胞中下降不顯著外，在其余細胞中均顯著低于對照。(4)原來相對含量居第2位、與Mg元素相當?shù)腒元素，鹽脅迫下其相對含量在棗葉所有組織的細胞中均顯著升高，在上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中增幅分別達74.0％、198.9％、30.5％、78.4％、126.9％、240.5％及231.0％，其中在下表皮、木質(zhì)部、韌皮部和薄壁組織的細胞中躍居第1位，顯著高于Ca元素。(5)鹽脅迫下棗葉細胞巾Mg和Si相對含量的變化相似，只是Si的變幅更大：在上表皮、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中，2種元素的相對含量均顯著下降，降幅分別為25.2％、35.3％、27.4％、45.7％、48.9％和74.8％、64.7％、72.6％、54.3％、51.1％，在下表皮和海綿組織的細胞中則表現(xiàn)為升高，增幅分別為12.8％、6.6％和204.5％、268.9％。

與鹽脅迫下不加Si相比，鹽脅迫下加Si對金絲小棗葉片各組織細胞中8種礦質(zhì)元素相對含量的影響存在顯著的細胞間、元素間的差別：(1)除海綿組織的細胞外，棗葉其余組織的細胞中Na元素相對含量均顯著降低，存上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中降低幅度分別為42.3％、48.9％、17.9％、32.5％、38.0％、30.5％及39.2％。(2)棗葉各組織的細胞中，Cl元素相對含量均降低，存上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中降低幅度分別為43％、30.1％、9.2％、28.0％、42.0％、35.4％及49.7％，其中在木質(zhì)部、韌皮部及薄壁組織的細胞中達顯著差異水平。(3)棗葉木質(zhì)部、韌皮部細胞中K元素相對含量小幅下降，降幅分別為5.4％、7.2％，而在上表皮、下表皮、海綿組織、柵欄組織及薄壁組織的細胞中則不同程度地升高，增幅分別為42.6％、11.2％、49.1％、40.4％及4.7％，其中在上表皮、海綿組織、柵欄組織的細胞中達顯著差異水平。(4)棗葉細胞中Ca元素相對含量有升、有降，但變化幅度較小，其中：在上表皮、韌皮部、薄壁組織的細胞中降低，降幅分別為14.6％、0.9％、4.0％；在下表皮、海綿組織、柵欄組織和術質(zhì)部細胞中升高，增幅分別為3.6％、0.2％、3.4％和56.9％，只有在木質(zhì)部細胞中達顯著性差異水平。(5)和Ca元素相似，Mg元素相對含量也是有升、有降，但變化幅度大：在下表皮、韌皮部和薄壁組織的細胞中為升高，增幅分別為12.4％、25.7％和10.9％：在上表皮、海綿組織、柵欄組織和木質(zhì)部細胞中為降低，降幅分別為41.4％、33.5％、37.2％和38.5％，其中在上表皮和海綿組織的細胞中達顯著性差異水平。(6)Si元素相對含量在棗葉下表皮細胞中顯著下降，降幅達66.7％，而在上表皮、海綿組織、柵欄組織、木質(zhì)部、韌皮部和薄壁組織等其余組織的細胞中均顯著升高，增幅分別達559.0％、69.3％、149.0％、108.3％、101.3％和306.6％(表1)。

因此，鹽脅迫下棗葉細胞中相對含量變化(增大或減小幅度)最大的元素為Na和K，次為Si和C1，Ca和Mg所受影響相當；鹽脅迫下加Si處理，相對含量變化最大的元素為Si，其次是Na，Cl、Mg、K相對含量的變化幅度相當，Ca相對含量變化很小。鹽脅迫下棗葉表皮、葉肉及葉脈細胞中P元素相對含量總體上減小；鹽脅迫下加Si，棗葉細胞中P相對含量表現(xiàn)為一定幅度的升高，特別是在上、下表皮細胞中。但總體上與對照及鹽脅迫下不加Si之間的差異不顯著，所受影響較小。鹽脅迫及鹽脅迫下加Si處理，棗葉細胞中S元素相對含量的變化及其規(guī)律性比P的更弱(表1)。

2.2 硅對鹽脅迫下金絲小棗葉片細胞中礦質(zhì)元素平衡的影響

由表2可見，與對照相比，鹽脅迫下棗葉細胞中K、Ca、Si元素與Na、Cl元素之間的平衡關系發(fā)生了顯著改變。棗葉表皮、葉肉細胞中的鉀鈉比(K／Na)均減小，其中在海綿組織的細胞中顯著減小，減小幅度達53.8％，在葉脈木質(zhì)部、韌皮部和薄壁組織的細胞中則悉數(shù)增大，增幅分別為25.6％、22.5％和61.1％：鉀氯比(K／C1)在幾乎所有的棗葉細胞中均增大，但只是在韌皮部細胞中達顯著差異水平，在其余細胞中均與對照無顯著性差異。鹽脅迫下，棗葉所有細胞中的鈣鈉比(Ca／Na)均顯著小于對照，鈣氯比(Ca／C1)也表現(xiàn)出減小的趨勢，但只在部分細胞中達顯著性差異水平；硅鈉比(Si／Na)、硅氯比(Si／CI)在棗葉各個組織的細胞中基本上均顯著減小。

與鹽脅迫下不加Si相比，鹽脅迫下加Si處理，金絲小棗葉片各個組織的細胞中K／tNa、K／C1、Ca／Na、Ca／C1、Si／Na、Si／C1均不同程度地增大。其中，K／Na在棗葉所有細胞中均顯著增大，K／C1在韌皮部和薄壁組織的細胞中顯著增大，Ca／Na在韌皮部細胞中顯著增大，Ca／CI木質(zhì)部和薄壁組織的細胞中顯著增大；除在下表皮細胞中未增大外，Si／Na和Si／C1在棗葉其余組織的細胞中顯著增大，在上表皮、海綿組織、柵欄組織、薄壁組織的細胞中甚至大于對照，增幅分別達10.36倍和24.49倍、1.00倍和0.89倍、3.76倍和2.46倍、5.46倍和7.43倍；在木質(zhì)部和韌皮部細胞中，Si／Na、Si／CI雖然與鹽脅迫下不加Si的無顯著性差異，但增幅也很大，分別為2.46倍和1.55倍、2.00倍和2.38倍(表2)。

3 討論

X-射線能譜(EDX)分析法在揭示植物體內(nèi)礦質(zhì)元素微域分布、精確定位、生理功能及其與環(huán)境適應關系方面的作用愈來愈受到關注。K、Na、Ca、Mg、Cl等5種元素被植物根系吸收、運輸?shù)男螒B(tài)分別是k⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-，在植物體內(nèi)存在的狀態(tài)除一部分Ca、Mg元素與有機物結(jié)合外，大多數(shù)還是呈離子態(tài)存在的，因此，測試出來的這些元素在細胞中的相對含量基本上就是它們離子的相對含量。Si元素被植物吸收利用的形態(tài)主要是單硅酸(H2Si04)，存在形態(tài)主要是SiO₂·nH₂O；P和S元素被植物根系吸收、運輸?shù)闹饕螒B(tài)分別是正磷酸(HP042一和H₂PO₂^-)和SO₄^2-，在植物體內(nèi)的存在形態(tài)則較多樣，但無論它們以何種形態(tài)被吸收利用或存在，它們的元素相對含量均與離子相對含量呈密切的線性關系，并可實現(xiàn)定量分析。

迄今，人類研究植物耐鹽生理至少已有80年歷史，在最近的20年間進展尤其迅速。現(xiàn)已確證，鹽脅迫對植物產(chǎn)生傷害的機制主要是滲透脅迫、離子毒害和營養(yǎng)虧缺，其中最重要的機制在于植物因吸收、積累過多的鹽分離子而對細胞膜系統(tǒng)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶、1.5一二磷酸核酮糖(RuBP)羧化酶等酶蛋白產(chǎn)生的直接傷害，以及因此而誘導的一系列活性氧(ROS)傷害。濱海地區(qū)的鹽土，居支配地位的鹽類是NaCl。對于大多數(shù)植物，NaCl脅迫下產(chǎn)生毒害效應的鹽分離子主要是Na⁺，次為Cl^-，但對另外一些植物，Cl一的毒害效應可能大于Na⁺。總體而言，鹽分離子對植物的毒害效應在很大程度上取決于鹽分離子在植物體內(nèi)的含量、分布、比值及植物的耐鹽性。

對金絲小棗葉片所做的EDX分析結(jié)果表明，受鹽脅迫的棗樹，其葉片所有組織的細胞中Na、CI元素相對含量均較對照升高，但Na元素相對含量顯著升高，Cl元素相對含量升高幅度明顯較小，同時，Si、Ca、Mg元素相對含量在大多數(shù)組織的細胞中顯著下降，細胞中K、Ca、si元素與Na、Cl元素相對含量的比值明顯改變，特別是表皮和葉肉細胞中K／Na顯著下降，Ca／Na和Si／Na幾乎在所有棗葉細胞中均顯著下降，說明鹽脅迫對金絲小棗葉片的傷害也主要源于Na+的積累及其導致的胞內(nèi)離子平衡的嚴重失調(diào)。本文的EDS結(jié)果同已經(jīng)報道的大多數(shù)淡土植物在鹽脅迫下器官水平上鹽分離子的分配情況相似，但鹽脅迫下棗葉細胞中Si／Na也顯著下降系在植物中首次報道。同時，此種鹽脅迫下棗葉所有細胞中K元素相對含量均較對照顯著升高則暗示該棗樹品種具有較強的保持葉片細胞中K’穩(wěn)態(tài)、進而增強滲透調(diào)節(jié)的能力。普遍認為K’是植物體內(nèi)重要的無機滲調(diào)物質(zhì)，而這種能力很可能與其具有較強耐鹽性有密切關系。此外，同為葉肉細胞，鹽脅迫下金絲小棗葉片柵欄組織的細胞中Na、Cl元素相對含量的升高幅度及K／Na、Ca／Na、Si／Na的降低幅度均明顯小于海綿組織的細胞，而K元素相對含量的升高幅度則明顯大于海綿組織的細胞，表明其葉肉中不同組織的細胞在鹽脅迫下的響應存在顯著差異，這暗示該品種棗樹在鹽脅迫下具有較強的保護葉綠體完整及光合機能正常的代謝機制。

與鹽脅迫相比，鹽脅迫下加Si的金絲小棗，葉片各個組織的細胞中礦質(zhì)元素相對含量均發(fā)生顯著變化，其中變化幅度最大的是Na、Cl、K、Si4種元素：在葉綠體主要分布的柵欄細胞中，K元素相對含量升高的幅度與Na、Cl元素相對含量降低的幅度超過28.0％；除下表皮細胞外，其他所有細胞中Si元素相對含量甚至成倍升高。同時，棗葉細胞中礦質(zhì)元素相對含量間的比值也顯著改變，尤以K／Na、Si／Na和Si／C1的顯著增大最突出。由于Si元素不僅在棗葉上表皮細胞中大幅積累，而且在除下表皮細胞外的其他組織的細胞中相對含量也是成倍升高，以至所有細胞中Si／Na、Si／CI顯著升高的幅度甚至超過K／Na。這些結(jié)果同作者以前關于Si保護鹽脅迫下金絲小棗葉片柵欄細胞超微結(jié)構、改善棗葉光合作用的報道相一致，再次佐證Si緩解鹽脅迫對金絲小棗的傷害、提高其耐鹽性，結(jié)果同Liang等關于Si對鹽脅迫下大麥(Hordeum vulgate L.)根尖離子微域分布、徐呈祥等關于Si對鹽脅迫下蘆薈(Aloevera L)離子吸收分配的影響的報道相似，但鹽脅迫下加Si處理，棗葉大多數(shù)組織的細胞中Ca元素相對含量升高不明顯，P元素相對含量變化很小，Mg元素相對含量基本上持續(xù)降低，Si影響鹽脅迫下金絲小棗對礦質(zhì)元素選擇性吸收與分配的機理需進一步研究。