杧果葉綠素a/b結合蛋白基因cDNA全長克隆及其序列分析

摘要：采用RT-PCR方法克隆得了杧果葉綠素a／b結合蛋白基因(Cab)cDNA全長序列，命名為Mcab(cenBankaccessionNo.FJ907952)。Mcab基因全長為915 bp，編碼264個氨基酸。推測蛋白質分子質量為28.19 ku，等電點為5.35。同源性分析表明，Mcab基因在不同植物中的一致性為72％～85％。實驗分析表明，杧果Mcab基因編碼的蛋白中第63～232位有一個捕光葉綠素a，b結合蛋白功能域，并且在木本植物中非常保守。亞細胞定位分析顯示Mcab蛋白被定位于葉綠體，它所編碼的蛋白質在綠色植物光合系統中起著重要作用。蛋白二級結構預測顯示，Mcab蛋白有8個α-螺旋，5個B折疊區，21個β-轉角。研究將有助于進一步了解杧果光合作用的分子機制。

關鍵詞：杧果；葉綠素a，b結合蛋白基因；克隆；序列分析

中圖分類號：S665.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2010)03-441-04

光能是整個光合作用反應的驅動力，而光合作用是自然界中最重要的化學反應，綠色植物通過捕光葉綠素結合(LHC)蛋白接收太陽能來同化C0：。在高等植物體內，捕光葉綠素a/b結合蛋白基因(Cab)屬于光合系統基因，它所編碼的捕光色素蛋白復合體(LUG)是一類捕獲光能，并把能量迅速傳至反應中心引起光化學反應的色素蛋白復合體，研究發現它們在維持類囊體膜的結構、調節激發能在2個光系統之間的分配、光保護以及對各種環境的適應等過程中都起著重要的作用。LHC蛋白家族成員眾多，它們在光系統I(PSI)和光系統Ⅱ(PSⅡ)中起重要的作用，近年來這個領域的研究非常活躍，已經取得很大的進展。目前已有一些葉綠素a/b結合蛋白基因從木本植物中被分離克隆出來。

我們根據植物Cab家族基因中的保守序列設計引物，利用RTPCR技術從杧果cDNA中克隆得到Mcab基因全長序列，目的在于深入了解Mc如基因在杧果中的結構和功能特性，為從分子水平了解杧果的光合作用機理提供依據。

1 材料和方法

1.1 植物材料

紫花杧葉片采自廣西大學農學院教學科研基地果樹標本園

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 采用優化后的肖潔凝等提取杧果RNA的方法。

1.2.2 引物設計與PCR反應 根據植物Cab基因家族中的保守序列設計1個上游引物Cab-UP：5′-GGACAATGGCAGCCTCAACC-3′：逆轉錄引物為AUPI：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)₁₈-3′；3′端通用下游引物3side：5′-GGCCACGCGTCGAC—TAGTAC-3′。cDNA第1鏈的合成用M-MLV逆轉錄酶，逆轉錄引物為AUPl，步驟按說明書進行。擴增Mcab基因的反應體系為25μL，第1鏈產物1μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，上下游引物(10μmol·L^-1)各0.5μL，Tap酶0.2μL，buffer緩沖液2.5μL，加超純水19.8μL。擴增參數為：94℃預變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40個循環；72℃延伸10min。PCR產物在1.2％的瓊脂糖凝膠上電泳，用Biospin Gel Extraction Kit從凝膠上回收、純化目的條帶。

1.2.3 目的片段的克隆 取4.2μL回收產物、5μLSolutionI連接緩沖液和0.8μL pMDl8-T載體4℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JMl09菌株感受態細胞，通過藍白斑篩選挑取白色菌落，經菌液PCR驗證、質粒長度對比和酶切鑒定獲得重組質粒，委托上海生工測序。

1.2.4 序列的生物信息學分析 用GenBank Blast在線軟件分析杧果Mcab同源基因與其他植物Cab基因核苷酸序列同源性：用BioXM軟件推測Mcab基因的氨基酸序列；用DNAMAN軟件構建Mcab基因氨基酸序列系統進化樹；用SMART和ScanProsite等軟件對杧果Mcab蛋白的功能結構域進行分析：用DNASTAR軟件對卡亡果Mcab蛋白進行二級結構預測。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與克隆

用紫花卡亡葉片RNA為模板，逆轉錄引物AUPl合成cDNA(圖1)，再以cDNA為模板，用引物Cab-UP和3side從eDNA中擴增得到長約920 bp的條子委托上海生工測序，經測序得到915 bp的序列。

2。2 杧果Mcab基因序列分析

通過GenBank Blast對所得到的序列進行搜索比對，顯示其為葉綠素a/b結合蛋白基因(Cab)，命名為Mcab，登陸號為：FJ907952。該基因全長為915bp，包含啟始密碼ATG和終止密碼TGA，為Cab基因全長序列。從第4bp到第795bp含有1個長為792 bp的開放閱讀框(0pen reading frame，ORF)，編碼264個氨基酸(圖3)。

2.3 杧果Mcab基因生物信息學分析

用SMART和MOTIFSCAN在線分析軟件對Mcab基因編碼的氨基酸進行分析.顯示第63~232位包括一個典型的捕光葉綠素a/b結合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain)，第34～36、38～40、233～235為蛋白激酶C的磷酸化位點(Protein kinaseC phosphorylation site)，第107～112、121-126、168～173、177～182為N-肉豆蔻酰位點(N-myristoylationsite)。用TMpred在線軟件預測Mcab蛋白序列跨膜區，顯示其包含3個典型的跨膜區域，在98-118、155～173、218～234 3個區域。用SOSUIsignal預測信號肽，顯示Mcab不含信號肽，屬于膜蛋白。用WoLFPSORT進行亞細胞定位，顯示卡亡果Mcab蛋白被定位于葉綠體。Mcab所編碼的蛋白質分子量為28.2ku，正電氨基酸占9.4％，負電氨基酸占9.8％，等電點為5.35。

2.4 Meab蛋白二級結構預測分析

用DNASTAR對Mcab蛋白二級結構進行分析，根據Chou-Fasman的經驗參數法，顯示Mcab蛋白有8個Or--螺旋，5個B折疊區，21個β一轉角。Mcab蛋白是一個膜蛋白，具有3個典型的跨膜區域，分布在98～118、155～173、218～234區域，而在這3個區域內氨基酸多為疏水性氨基酸，無抗原性，也不構成表面結構。

2.5 Mcab基因進化分析

把Mcab基因核苷酸序列進行GenBank Blast比對，發現有77個不同物種的Cab基因序列與其同源性較高，相似系數在72％～85％，其中與陸地棉相似系數最大為85％，與傘藻屬蝶狀藻相似系數為72％，說明Cab基因在長期的進化過程中相當保守。在木本植物中，卡亡果Mcab基因的氨基酸序列與梔子(Gardenia，asminoides)的相似系數最高為93％，與桃(Prunus persica)最低為88％，其中又以捕光葉綠素aPo結合蛋白功能域最為保守，杧果Mcab蛋白第63-232位為捕光葉綠素a／b結合蛋白功能域，毛竹為第62～239位，胡楊為第62～230位，綠竹為第62～230位。

用DNAMAN軟件對杧果Mcab基因與部分木本植物Cab同源基因氨基酸序列進行系統進化分析，所有木本植物均聚類到一起，其中梔子、杧果、乳漿大戟同源性最近而聚到一起，山核桃、桃、歐洲山毛櫸、美洲山楊也聚為一類，葡萄屬于藤本植物而綠竹屬于禾本科多年生木質化植物則被單獨聚為一類(圖4)。因此利用同源基因的進化可以推斷木本植物各科屬間的進化關系。

3 討論

光合作用是自然界中最重要的化學反應，是生命活動賴以生存和繁衍的物質基礎。目前許多學者對Cab基因進行了研究，研究結果表明Cab基因的表達不僅受光和晝夜節律的調控，而且還受到植物不同的發育階段與激素水平的影響。由于cab基因在進化的過程中相當保守，因此推測杧果Mcab基因可能也受上述因子的調控。然而在序列分析中發現，杧果Mcab蛋白不含信號肽，具有3個典型的跨膜結構，屬于膜蛋白，含有3個蛋白激酶C的磷酸化位點和4個N-肉豆蔻酰位點。胡楊的PeCab蛋白的N末端包含由42個氨基酸組成的轉運肽，含有2個蛋白激酶C的磷酸化位點，不含N-肉豆蔻酸化位點。在毛竹中含有1個N-糖基化位點，一個酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點，5個N-肉豆蔻酸化位點。由此可見不同物種的Cab蛋白在結構和功能域上存在差異，因此可以推測不同物種的光和特性和Cab蛋白在光和作用過程中的功能可能存在著不同。

目前對卡亡果光和作用的研究主要是從生理生化方面進行，研究結果表明卡亡果也存在著光抑制現象。光和作用是一個復雜的過程，需要結合分子生物學來進一步加深了解。本研究首次從木本植物卡亡果中分離克隆得到葉綠素a/b結合蛋白基因(Mcab)，對其序列特性及其編碼蛋白質的生物信息學和蛋白質二級結果進行了分析，為進一步了解卡亡果的光和作用特性和光合作用分子機制打下基礎。