分光光度法測定蘋果果實總黃酮含量的條件優化

摘要：以富士、紅星、金冠、國光蘋果果實為試材，對分光光度法測定蘋果果實總黃酮含量的條件進行了優化。結果表明，標準品以兒茶素為宜；檢測波長以500nm為宜；氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁均可作顯色劑；與25℃和40℃相比，4℃下顯色更加穩定：顯色反應體系中乙醇濃度以8％為宜。在優化后的條件下測定蘋果果實總黃酮含量，黃酮濃度在50～300mg·L^-1，內有良好的線性關系，相關系數在0.999以上；兒茶素在果皮中的添加回收率為100.8％～104.9％(添加3 804～6410mg·L^-1)，在果肉中的添加回收率為101.7％～105.0％(添加500mg·kg^-1或1 000mg·kg^-1)；方法RSD小于5.0％。

關鍵詞：蘋果果實；總黃酮；測定；分光光度法；條件優化

中圖分類號：S661.1

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980(2010)03-466-05

類黃酮是一類多酚化合物，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗過敏、擴張血管等生理功能。蘋果果實富含類黃酮，Tsao等對8個蘋果品種進行了測定，類黃酮含量在834.2～2300.3mg·kg^-1(果皮)和15～605.6mg·kg^-1。(果肉)。類黃酮測定方法是研究蘋果果實類黃酮組成與含量的基礎。蘋果果實類黃酮的測定通常采用液相色譜法，類黃酮經色譜柱分離后，用相應的標準品進行定性和定量。但液相色譜法并不適于蘋果果實總黃酮含量的測定。究其原因，蘋果果實中已報道的類黃酮超過30種，而多數類黃酮沒有標準品。目前，蘋果果實總黃酮含量測定報道甚少，均采用分光光度法，以硝酸鋁為顯色劑，以蘆丁為標準品，檢測波長為500nm或510nm。然而，筆者試驗顯示，該方法用于蘋果果實總黃酮含量測定存在較多缺陷，檢測條件有待系統研究。為此，對標準品種類、顯色劑種類、檢測波長、環境溫度、顯色反應體系中乙醇濃度等進行了篩選和優化，旨在確定分光光度法測定蘋果果實總黃酮含量的適宜條件。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為富士、紅星、金冠和國光蘋果果實。購自水果超市。

1.2 方法

1.2.1 樣液制備 稱取蘋果果肉200 g，加入100mL80％乙醇，勻漿3min。稱取15g樣品，加入30mL80％乙醇，漩渦混勻0.5min，放置3 h，超聲提取30rain，抽濾，濾渣再超聲提取2次(每次加20mL 80％乙醇)，合并濾液，用80％乙醇定容至100mL，得果肉樣液。削取蘋果果皮(厚約1mm)，凍干，粉碎。稱取1g樣品，加入30mL 80％乙醇，以下操作同“果肉樣液的制備”，得果皮樣液。

1.2.2 總黃酮含量測定 吸取1mL樣液或標準溶液于10mL容量瓶中，加入5mL蒸餾水和0.3mL5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，加人0.3mL 10％鋁鹽溶液，搖勻，放置5min，加入2mL1mol·L^-1氫氧化鈉溶液，搖勻，蒸餾水定容，測定500 nm吸光度(A₅₀₀)。樣品總黃酮含量以鮮質量計。

1.2.3 測定條件篩選與優化 分別吸取兒茶素、蘆丁、槲皮素和根皮苷溶液(200 mg·L^-1)，以氯化鋁為顯色劑，按1.2.2操作，定容后進行200～700mm波長掃描，確定適宜標準品。吸取1mL200mg·L^-1兒茶素溶液或樣液，分別以氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁為顯色劑，按1.2.2操作，定容后進行200-700nm波長掃描，確定適宜顯色劑。吸取1mL200mg·L^-1兒茶素溶液或樣液，以氯化鋁為顯色劑，按1.2.2操作，定容后在4℃、25℃或40℃環境溫度下放置2h(其間。每隔20min測定1次A₅₀₀)，確定適宜環境溫度。反應體系設8％和50％2種乙醇濃度，以氯化鋁為顯色劑，按1.2.2操作(乙醇濃度為50％時，將“加入5mL蒸餾水”改為“加入4.2mL無水乙醇”)，確定反應體系適宜乙醇濃度。以空樣品池為參比，分別對試劑空白、樣液和顯色后樣液進行400～600nm波長掃描。分析背景成分對測定結果的影響。

1.2.4 方法學考察 用80％乙醇配制50、100、150、200、250和300 mg·L^-1兒茶素溶液，以氯化鋁為顯色劑，按1.2.2操作，測定A₅₀₀，繪制標準曲線，確定適宜濃度范圍。分別用果肉和果皮制備樣液，以氯化鋁為顯色劑，測定總黃酮含量，計算相對標準偏差，考察方法精密度。分別在果皮和果肉中添加一定量的兒茶素，制備樣液，以氯化鋁為顯色劑，測定總黃酮含量，計算添加回收率，考察方法準確度。

2 結果與分析

2.1 標準品的篩選

兒茶素、蘆丁、槲皮素、根皮苷等4種類黃酮標準品溶液顯色后進行波長掃描，結果見圖1。在紫外光譜區，除槲皮素和根皮苷的第2個吸收峰外。其余吸收峰均過于尖銳，以其最大吸收波長為檢測波長，會使檢測結果受波長誤差影響大、標準曲線線性范圍過窄；槲皮素和根皮苷的第2個吸收峰雖然不尖銳，但峰形不好、譜線不光滑，難以選擇到適宜的檢測波長。在可見光譜區，根皮苷和槲皮素均無最大吸收峰；兒茶素和蘆丁分別在500 nm和510nm有一最大吸收峰，且2者峰形相似、譜線平滑。兒茶素在500nm處的響應值比相同濃度蘆丁在510 nm處的響應值高0.4倍多，表明兒茶素比蘆丁更靈敏，故選擇兒茶素為標準品。Fawbush等在測定恩派蘋果果實總黃酮含量時即以兒茶素為標準品。

2.2 顯色劑的選擇

兒茶素溶液分別用氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁顯色后進行波長掃捕，結果見圖2。從圖2可見。3條圖譜不僅峰形一致，而且幾乎完全重疊。新紅星蘋果的果皮提取液和果肉提取液分別用氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁顯色后進行波長掃描，所得圖譜(本文未給出)與兒茶素溶液情況類似。這表明。在測定蘋果果實總黃酮含量時，氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁均可作顯色劑，這與前人報道相一致。

2.3 檢測波長的選擇

應用分光光度法進行測定時，為使測定結果有較高的靈敏度，通常應選擇被測物質溶液的最大吸收波長，不僅吸光度值較大，且受分析波長誤差影響較小。兒茶素溶液顯色后在紫外光譜區250nm和330mm各有一吸收峰，在可見光譜區有500nm吸收峰(圖3)。蘋果果皮提取液和果肉提取液也有3個吸收峰，且位置與兒茶素極為接近，但紫外光譜區的兩個峰峰形與兒茶素差異很大，表明果實提取液中類黃酮以外的其他成分對類黃酮吸收紫外光有較強的干擾：可見光譜區的吸收峰峰形與兒茶素幾乎完全一致，表明提取液中類黃酮以外的其他成分對類黃酮吸收可見光影響不大，而且該峰較矮、較寬，采用其最大吸收波長為檢測波長，標準曲線線性范圍大。因此，確定500nm為測定蘋果果實總黃酮含量檢測波長。

2.4 環境溫度對顯色穩定性的影響

兒茶素溶液用氯化鋁顯色后，其A₅₀₀隨放置時間延長而下降，而且下降速度與環境溫度有關，環境溫度越高下降越快(圖4)。顯色定容后將溶液放置在4℃環境溫度下，A₅₀₀下降緩慢，平均每小時下降5.3％。而將溶液放置在25℃和40℃環境溫度下，A⁵⁰⁰急速下降，平均每小時分別下降33.5％和43.5％。蘋果果肉和果皮提取液與兒茶素溶液情況類似，但A⁵⁰⁰下降速度較慢，約為兒茶素溶液的1／5。有鑒于此，為保證測定結果準確，顯色定容后的溶液最好放置在4℃的低溫條件下，并盡快測定其Am，用兒茶素溶液繪制標準曲線時尤其如此。

2.5 顯色反應體系中乙醇濃度的影響

無論是蘋果果肉還是果皮，顯色反應體系中乙醇濃度為8％時的測定結果均明顯高于乙醇濃度為50％時的測定結果(表1)，特別是果皮，前者比后者高34.2％。試驗還發現測定蘋果果皮總黃酮含量過程中，當乙醇濃度為50％時，溶液顯色后有大量絮狀沉淀出現。在銀杏葉、竹葉和桑黃總黃酮含量測定時也發現了類似問題，這是雜質造成的，雜質在堿性環境下與鋁離子形成絡合物沉淀，致使測定準確度和重現性變差。將顯色反應體系中乙醇濃度降至8％，避免了顯色后沉淀的出現，而且比采用離心或過濾的方法去除沉淀更加省時、高效，還可降低測定成本。

2.6 背景成分對測定的影響

采用分光光度法進行樣品檢測時，參比溶液應包括除待測成分以外的全部背景成分。波長掃描圖譜顯示，測定蘋果果皮和果肉總黃酮含量時，試劑空白和未顯色果實提取液對400-600nm可見光均有一定程度的吸收(圖5)。應將其扣除，否則會對測定結果產生干擾，使測得的蘋果果實總黃酮含量出現虛高現象。以空樣品池為參比測定未顯色果實提取液的500nm吸光度(A₅₀₀)，再以空白試劑為參比測定果實提取液顯色后的500 nm吸光度(A₅₀₀)，2者之差(A⁵⁰⁰-A⁵⁰⁰’)即為真實吸光度，以此計算果實提取液的總黃酮濃度即可扣除背景成分對測定的影響。

2.7 方法的線性范圍

根據50-300mg·L^-1兒茶素系列標準溶液顯色后的A₅₀₀繪制標準曲線，回歸方程為C=392.65A_{500-4.05，相關系數R。為0.9998，可見兒茶素溶液濃度與A500之間存在良好的線性關系。應用分光光度法測定樣品中某種成分的含量時，一般應控制被測試液的吸光度在0.2-0.7。由此推算。在進行蘋果果實總黃酮含量測定時，樣品提取液中類黃酮濃度最好控制在75-270 mg·L^-1，低于75 mg·L^-1。進行適當濃縮，高于270mg·L^-1進行適當稀釋。}

2.8 方法的準確度和精密度

用富士、紅星、金冠和國光蘋果果實進行方法準確度試驗和精密度試驗。結果顯示，果皮中添加3 804～6410mg·kg^-1兒茶素，回收率在100.8％～104.9％：果肉中添加500 mg·kg^-1或1 000 mg·kg^-1兒茶素，回收率在101.7％～105.0％(表2)。果皮重復樣品的總黃酮含量相對標準偏差在0.5％～5.0％，果肉重復樣品的總黃酮含量相對標準偏差在0.6％～1.8％，均不超過5％(表3)。這表明，在優化后的條件下。蘋果果實總黃酮含量測定結果準確、重復性好。

3 討論

蘋果果實所含類黃酮種類相當多，高效液相色譜法適于類黃酮單體的測定㈣，但因標準品種類的限制，該方法僅能測定其中部分類黃酮，而采用分光光度法則可實現蘋果果實總黃酮含量的測定。

蘆丁溶液顯色后其可見光譜區最大吸收波長為510nm，并非報道的500nm。采用兒茶素為標準品，靈敏度明顯高于蘆丁，而且可見光譜區最大吸收波長是500nm(圖1)。鋁鹽是分光光度法測定蘋果果實總黃酮含量的顯色劑，鋁離子與黃酮化合物形成穩定的配合物。顯色反應中分別加入氯化鋁、硝酸鋁和硫酸鋁，A₅₀₀幾乎完全一致(圖2)，因此，選擇其中任何一種鋁鹽作顯色劑均可。雖然有人采用A₅₀₀測定蘋果果實總黃酮含量，但本研究表明，可見光譜區的最大吸收峰并不在510nm，而在500nm(圖3)，這與王建華等舊的報道相一致。500nm吸收峰較矮、較寬(圖3)，以500nm為檢測波長，可獲得較大的標準曲線線性范圍。

分光光度法測定總黃酮含量時，顯色定容后的環境溫度對測定結果有影響，必要時應針對具體樣品對其進行優選。本文進行了對比研究，顯色定容后的環境溫度以4℃為宜，溶液A₅₀₀下降速度明顯比環境溫度為25℃和40℃時慢，反映出顯色反應生成的紅色配合物在低溫條件下更為穩定。采用分光光度法測定總黃酮含量時，顯色反應體系中乙醇濃度不同。實驗結果差異很大㈣。本研究證明了這一現象，無論是蘋果果皮還是果肉，乙醇濃度為8％時的測定結果均明顯好于乙醇濃度為50％時的測定結果，而且高乙醇濃度條件下測定蘋果果皮總黃酮含量時還會出現明顯的絮狀沉淀。

分光光度法具有應用范圍廣、靈敏度高、準確度好、操作簡便等優點。本研究結果反映了這些優點，在優化后的條件下，采用分光光度法測定蘋果果實總黃酮含量，線性范圍寬，精密度和準確度高。本研究結果為蘋果果實總黃酮含量分光光度法測定奠定了基礎。