越橘種質資源遺傳多樣性和親緣關系研究

摘要：利用SSR分子標記技術，對93份越橘種質資源遺傳多樣性和親緣關系進行分析。22對SSR引物共擴增出164個位點，多態性帶百分率較高，為96.97％；香農多樣性指數為0.3052～0.5727，平均為0.4322；在閾值0.70處供試資源可以分為五組：矮叢越橘(包括狹葉越橘和絨葉越橘)、北高叢越橘、兔眼越橘、蔓越橘和篤斯越橘，其中北高叢越橘、矮叢越橘、兔眼越橘親緣關系依次漸遠；篤斯越橘、蔓越橘、兔眼越橘親緣關系依次漸遠。研究認為供試群體的遺傳多樣性較低，兔眼越橘、蔓越橘和北高叢越橘資源遺傳基礎較狹窄，在育種巾，需加強對野生資源和種間資源的利用。

關鍵詞：越橘：SSR；遺傳多樣性；親緣關系

中圖分類號：S663.6

文獻標識碼：A

文章編號：1009-9980f2010103-373-06

越橘為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，全世界越橘屬植物約有400個種，我國約有91個種，28個變種，分布于我國東北和西南地區。具有栽培利用價值的主要有8個種(其中本研究涉及6個種)，而在生產中，常按樹體特征、果實特點及區域分布將越橘劃分為6個品種群：兔眼越橘、高叢越橘、半高叢越橘、矮叢越橘、紅豆越橘和蔓越橘。越橘品種選育與栽培最早起源于美國，從1933年開始至今，陸續選育了多個優良品種。我國從1983年開始越橘引種栽培工作，先后從美國、加拿大、波蘭等國家引入栽培品種(系)100余個。但是，國內還未對這些資源進行較全面的親緣關系和遺傳多樣性研究，研究水平也停留在表型研究階段。

分子標記技術的應用，為種質資源的研究提供了有力手段，Levi等應用RAPD和SSR分子標記方法，鑒定了15份高叢越橘、2份兔眼越橘和1份矮叢越橘品種，對它們親緣關系進行了評價；Karen等應用RAPD技術研究了26份矮叢越橘，這些資源平均遺傳相似性為56％，并且認為RAPD分析技術是矮叢越橘基因型鑒定和遺傳相似性評價的有力工具：Boches等，應用SSR技術研究了69份高叢越橘資源，經遺傳相似性檢測，將野生資源和栽培資源相分離，南高叢越橘組和北高叢越橘組單獨聚類。

我們采用SSR標記技術對93份越橘栽培種質資源進行了親緣關系和遺傳多樣性分析，旨在從分子水平上揭示越橘種質間的親緣關系及遺傳多樣性，為今后越橘種質資源收集，引種和鑒定，雜交育種中親本的選配，分子標記輔助育種等方面提供數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料采自吉林農業大學小漿果資源圃，對于每1份資源，隨機選取3個植株，取幼嫩葉片。供試的93份材料，見表1，其中對于親本不詳或由于資源是種間雜交后代而未劃分分類地位的情況，在表1中給出了相應資源的“來源地”信息，以供參考分析。

1.2 總DNA的提取

用TIANGEN植物基因組試劑盒提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的質量，將DNA置于-20℃冰箱中保存。TIANGEN植物基因組試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.3 SSR-PCR擴增

本實驗所用的引物參照Boehes等設計的序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。共使用22對引物，引物名稱詳見表3。

SSR反應體系所用的10xBuffer、Mg²⁺、dNTPs、TaqDNA聚合酶均購自北京天根生化科技有限公司。SSR反應體系為：在20μL反應體系中，Mg²⁺濃度2.0mmol·L^-1，dNTPs濃度0.20mmol·L^-1，TaqDNA聚合酶用量為0.5U，引物濃度0.8μmol·L^-1，DNA模板1.5mg·L^-1。

PCR擴增程序為：94℃預變性4min，94℃變性40s，54～62℃退火40s，72℃延伸40s，35個循環，72℃后延伸8min。PCR擴增在Biometra-UNOⅡ型PCR儀上進行。擴增產物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳1.0h(70W)，參照Bassam等的方法銀染檢測，拍照。

按上述方法對全部材料進行SSR-PCR擴增，2次重復。

1.4 數據分析

將重復性好且清晰的條帶進行記錄，在相同位置有帶記為1，無帶記為0，構建0，1矩陣；采用Popgen32計算香農多樣性指數(Shannon’s Diversityindex)。采用DPS8.50軟件多元分析的0～1系統聚類方法，以Jaccard相似性系數，按類平均法(UPG-MA)構建親緣關系聚類圖。

2 結果與分析

2.1 不同SSR引物在越橘中的擴增多態性

利用22對SSR引物對越橘基因組DNA進行擴增，圖1為引物NA741對部分越橘基因組DNA的擴增情況。

由表2可知，22對引物擴增的多態性帶數從3到12條不等，其中引物CA421F和VCC-K4擴增的多態性帶最多，為12條；22對SSR引物擴增出了164條帶，多態性百分率較高，為96.97％，表明22對引物對供試群體進行了良好的擴增：平均觀測等位基因數為1.9697，有效等位基因數為1.4602，表明等位基因在群體中的分布較為均勻：香農信息指數為0.3052-0.572 7，平均為0.4322，表明群體的遺傳多樣性較低。

2.2 親緣關系聚類分析

由圖2可知，供試資源在閾值0.70處可以分為5組。由上而下依次為：

2.2.1 第1組為矮叢越橘共13份，包含2個種的資源，即狹葉越橘(V.angustfolium Aiton)和絨葉越橘(V.myritilloides Michaux)，其中8份資源屬于前一個種，絨葉越橘僅有1份資源，說明目前收集、研究和利用的矮叢資源主要來源于狹葉越橘：絨葉越橘為野生種，聚在了該組最下端，說明與狹葉越橘親緣關系較高叢越橘、兔眼越橘和蔓越橘等近，這與2者表現為矮叢越橘類型相一致。

此外，該組包括2個半高叢越橘：北村、北空，2者具有相同親本，聚在一起，雖然栽培上表現為“半高叢越橘”的特點，但在分子水平上，2者聚在矮叢越橘組，表明攜帶了較多矮叢越橘遺傳信息。還有2個雜交后代L12和L13，分別與矮叢越橘坤藍和依妹兒聚在一起。

2.2.2 第2組為北高叢越橘(V.corvmbosum L)同第1組相同之處在于該組也包括多個雜交品系和半高叢越橘品種，這是由于這些資源是北高叢越橘和狹葉越橘雜交后代，攜帶有2者的遺傳信息，但在種質資源學上則無分類地位，在栽培中主要按植株高矮、品質和抗寒性劃分，在親緣關系上缺乏分子水平劃分依據，此研究表明，聚在該組的品系和半高叢越橘品種攜帶有更多的北高叢越橘遺傳信息，即與北高叢越橘親緣關系較近。

從圖2可知，該組共包括聚類呈現了下列特點。

第一，半高叢越橘和雜交品系趨向首先聚在一起，可與北高叢越橘相區分，表明與北高叢越橘攜帶基因的差異。其中，半高叢越橘北藍、圣云、北陸、5115、5415聚在了該組最上端；雜交品系和半高叢越橘：L11、北極星、藍金到HL10共12份資源聚在該組下端；在半高叢越橘之間大部分為高叢越橘，伴有與之親緣關系較近的6份品系。

第二，具有相同父本和(或)母本一類資源傾向于聚在一起，甚至多個資源與同一親本相關，反映出遺傳基礎的狹窄。如埃利奧特和伯克利，都含有澤西和先鋒的血緣；斯巴坦和藍塔都含早藍的血緣，而早藍的親本之一維口，含有六月的血緣：又如藍豐，藍線和達柔親本等都與澤西、先鋒和六月有關：最典型的是瑞卡和普魯，是E118x藍豐雜交后代。

所以，國外越橘選育工作，使用頻率較高的資源有藍豐、澤西、先鋒、早藍、Ashworth、六月等，其中的藍豐，早藍等仍為部分地區主栽品種。

第三，有2份資源為野生種間雜交獲得，即普特(北高叢越橘×狹葉越橘)、艾朗(篤斯越橘×高叢越橘四倍體雜交再回交)，這是利用野生遠緣種質雜交，拓寬遺傳基礎而獲得優良后代的實例，在聚類圖上艾朗及H3、艾文豪聚在該組最外端，而普特聚在該組內部，可能因攜帶了較多高叢越橘遺傳信息，或與相鄰資源親緣關系較近而首先相聚。

2.2.3 第3組為兔眼越橘(V.ashei Reade，)共6份，組內資源間親緣關系較近。杰兔、燦爛首先聚在一起，二者母本均為梯芙藍：而芭爾德溫的父本也為梯芙藍；巨豐的父本為燦爛，與上述資源親緣關系亦較近，在聚類圖上表現為低閾值時，6份資源即相聚。

2.2.4 第4組為蔓越橘(V.macrocarpon L)共8份資源，該組資源缺乏親本資源信息，但從聚類圖上可知，8份資源親緣關系亦較近，距離較近的資源可能具有相同或近緣的親本。

2.2.5 第5紐為篤斯越橘(V.uliginosumL)共1份資源，篤斯越橘首先與蔓越橘聚在一起，而后與兔眼越橘聚類，親緣關系依次漸遠；其他幾組若以高叢越橘為參照組，親緣關系依次漸遠的順序應為：高叢越橘、矮叢越橘、兔眼越橘。

3 討論

3.1 親緣關系與育種

本研究表明，因一個品種(系)群可含有多個“種”的基因，即品種群內部存在“種”水平上基因差異，從而也決定了表型上的差異，矮叢越橘品種群與絨葉越橘或狹葉越橘有關：本研究中的很多半高叢越橘與高叢越橘聚為一組，說明攜帶矮叢越橘遺傳信息少，所以親緣關系復雜，加之某些資源親本信息不詳等情況，在育種工作中應參考分子水平的親緣關系數據。

3.2 越橘野生資源的收集、保存和評價工作有待加強

由于越橘引種栽培工作始于上世紀80年代，并且主要以較多栽培的北高叢越橘、矮叢越橘和半高叢越橘為主進行引種試栽，可供研究和利用的野生資源較少，如本研究中還缺乏紅豆越橘、南高叢越橘等重要野生種資源信息，絨葉越橘、篤斯越橘也缺乏資源群體信息。

而且，由于目前越橘產業在我國發展迅速，也凸顯了越橘種質資源研究、育種與產業發展間的不協調性；而中國越橘野生資源豐富，已知的越橘屬植物有91種，其中發現已有或可能有經濟利用潛力的有南燭組(Sect.B racteata)、濕生越橘組(sect.U ligi-nosa)、蔓越橘組(Sect Oxycoccus)、黑果越橘組(Sect，Vaccinium)、篤斯越橘(V，uliginosun L)和越橘組(Sect.V.Vitis-idaea)的某些種類，應對這些資源進行系統的收集、評價，并利用這些資源創制新種質。

研究認為由于種內雜交、種間和野生資源利用較少，致使供試群體的遺傳多樣性較低、遺傳基礎較狹窄。今后育種工作應重視野生資源和種間資源的利用，參考本文各組間，組內資源親緣關系的量化數據，可選擇適宜資源，雜交選育越橘新品種。