鴨梨葉片不定芽再生體系的建立

摘要：為建立鴨梨(Pyrus 6retschneideri Rehd.cv.Yali)葉片不定芽再生體系，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究了不同培養(yǎng)基、植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度、蔗糖含量對(duì)鴨梨葉片不定芽再生的影響。結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基是影響葉片不定芽的誘導(dǎo)、繼代和生根的關(guān)鍵因素，分別以NN69、MS和l／2MS為宜；IBA是影響葉片不定芽增殖的重要因素；最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+BA3.0mg·L^-1+IAA0.5mg·L^-1，再生頻率和再生芽數(shù)分別為80.00％和1.77；最適增殖培養(yǎng)基為MS+BAl.0mg·L^-1+IBA0.5mg·L^-1，增殖系數(shù)可達(dá)2.23；最適繼代培養(yǎng)基為MS+BAl.0mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1，平均苗高4.98cm；最適生根培養(yǎng)基為1／2MS+蔗糖30g·L^-1+IBA0.5mg-L^-1，生根率和平均根數(shù)分別為50.00％和2.04。該再生體系可為鴨梨遺傳轉(zhuǎn)化提供有效的受體系統(tǒng)。

關(guān)鍵詞：鴨梨；葉片；不定芽；再生

中圖分類號(hào)：S661.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980f2010)03-436-05

鴨梨(Pyms bretschneideri Rehd.cv.Yali)是我國(guó)重要的梨樹(shù)栽培品種之一，也是我國(guó)出口創(chuàng)匯的重要品種。但鴨梨抗病性差、貯藏易褐變導(dǎo)致食用和加工品質(zhì)下降，品種改良與更新是目前亟待解決的主要問(wèn)題。由于梨具有童期長(zhǎng)、基因雜合程度高、自交不親和、實(shí)生后代分離復(fù)雜等特性，使得傳統(tǒng)雜交育種非常困難。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，特別是遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的出現(xiàn)給育種工作提供了新的捷徑，而遺傳轉(zhuǎn)化的前提條件是建立高效的植株再生體系。目前僅在西洋梨、砂梨、白梨等某些品種上初步建立了離體器官再生體系，而鴨梨至今尚無(wú)完善的再生體系。為此本試驗(yàn)探討了不同培養(yǎng)基、激素及其濃度、蔗糖含量對(duì)鴨梨葉片不定芽再生的影響，初步建立了穩(wěn)定的再生體系.為后面開(kāi)展鴨梨遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2005—2008年在河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心植物組織培養(yǎng)室進(jìn)行。試驗(yàn)材料采自河北省農(nóng)林科學(xué)院果樹(shù)研究所梨園內(nèi)1株成年鴨梨樹(shù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得 2005年春從鴨梨樹(shù)上采集芽剛剛萌動(dòng)的幼嫩枝條，并將其剪成1～2cm的帶芽枝段，常規(guī)消毒后接種到經(jīng)預(yù)試驗(yàn)篩選的初代培養(yǎng)基(MS+BA0.5mg·L^-1NAA0.3mg·L^-1)上，待腋芽萌發(fā)后，切取長(zhǎng)約1cm的新生帶芽莖段，及時(shí)轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基上。取連續(xù)培養(yǎng)3代以上的無(wú)菌苗頂部展開(kāi)的2～4枚幼嫩葉片，去掉葉柄，垂直于葉片主脈橫切傷三刀，遠(yuǎn)軸面向下接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2周左右轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，誘導(dǎo)再生不定芽。不定芽生根采用二步生根法，先暗培養(yǎng)7d，然后再轉(zhuǎn)到不加激素的同類培養(yǎng)基上進(jìn)行光培養(yǎng)，30d后調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 培養(yǎng)條件

各處理的培養(yǎng)基均添加6g·L^-1瓊脂粉，除生根培養(yǎng)試驗(yàn)外，其他試驗(yàn)處理的培養(yǎng)基均添加30 g·L^-1蔗糖。pH 5.8～6.0，光周期(晝／夜)14／10h，光照強(qiáng)度2000lx，溫度(25±2)℃。每一處理接種6瓶，每瓶接5個(gè)外植體，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 所有試驗(yàn)均采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1、2、3和4)。

1.3 外觀指標(biāo)鑒定及數(shù)據(jù)處理

記錄接種葉片數(shù)、再生不定芽的葉片數(shù)、接種芽數(shù)、再生不定芽總數(shù)、增殖芽數(shù)、接種株數(shù)、生根株數(shù)和根數(shù)，測(cè)量苗高，并用目測(cè)法觀察無(wú)菌苗生長(zhǎng)狀態(tài)。

再生頻率(％)=再生不定芽的葉片數(shù)／接種葉片數(shù)x100

再生芽數(shù)=再生不定芽總數(shù)／接種葉片數(shù)

增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)，接種芽數(shù)

平均苗高(cm)=被調(diào)查苗高之和／被調(diào)查苗數(shù)

生根率(％)=生根株數(shù)／接種株數(shù)×100

平均根數(shù)(根／株)=被調(diào)查根數(shù)之和／被調(diào)查株數(shù)

苗生長(zhǎng)狀況的3個(gè)級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)：

1級(jí)苗(Class Ⅰ)：莖粗壯，葉舒展，濃綠，節(jié)間長(zhǎng)，苗高2 cm以上，生長(zhǎng)健壯；

2級(jí)苗(ClassⅡ)：莖粗矮，葉舒展，綠色，節(jié)間長(zhǎng)，苗高1-2cm，生長(zhǎng)中庸；

3級(jí)苗(ClassⅢ)：莖細(xì)矮，葉小，黃綠色，節(jié)間短，苗高1cm以下，生長(zhǎng)較弱。

將統(tǒng)計(jì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)列于正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表中，進(jìn)行極差分析，并用SPSSl2.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片不定芽的誘導(dǎo)

從表1可以看出，處理7的再生頻率最高，為80.00％，顯著高于其他8個(gè)處理，極顯著高于除處理9外的其他7個(gè)處理；處理7的再生芽數(shù)最多，為1.77，極顯著高于其他8個(gè)處理。由R分析可知，再生頻率的最佳組合為NN69+BA5.0mg·L^-1+IAA0.5mg·L^-1，再生芽數(shù)的最佳組合為NN69+BA3.0mg·L^-1+IAA0.5mg·L^-1，與處理7相符；影響再生頻率的主要因素順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基>IAA>BA，影響再生芽數(shù)的主要因素順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基>BA>IAA，可見(jiàn)，影響葉片再生的最大因素是基本培養(yǎng)基的種類，其次是激素的種類及濃度。所以確定最適葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+BA3.0mg·L^-1+IAA0.5mg·L^-1。

2.2 不定芽的增殖

由表2可以看出，處理3的增值系數(shù)最大，為2.23，且生長(zhǎng)健壯，芽多叢生，有較強(qiáng)的生長(zhǎng)勢(shì)，顯著高于其他8個(gè)處理，極顯著高于處理1和9。由R值分析可以看出，對(duì)于增殖系數(shù)的最佳組合為MS+BAl.0mg·L^-1+IBA0.5mg·L^-1，與處理3相吻合；影響增殖系數(shù)的主要因素順序?yàn)椋篒BA>BA>基本培養(yǎng)基，IBA是最主要的影響因子，基本培養(yǎng)基種類是最小的影響因子。所以確定不定芽最適增殖培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg·L^-1+IBA0.5 mg·L^-1。

2.3 不定芽的繼代

從表3可以看出，處理1和2的平均苗高較高。分別為4.75cm和4.98cm，且莖粗壯，葉濃綠，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，這2個(gè)處理在0.05和0.01水平上都不顯著，但極顯著高于其他7個(gè)處理。由R分析可知，對(duì)于平均苗高的最佳組合為MS+BA0.5mg·L^-1+NAA0.5mg·L^-1；影響苗高的主要因素順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基>NAA>BA，基本培養(yǎng)基種類是最主要的影響因子，BA是最小的影響因子。與處理2的組合MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5 mg·L^-1相比，僅僅是所加BA的濃度不同，由于BA濃度是最小的影響因子，再綜合不定芽的實(shí)際生長(zhǎng)情況，所以可以確定不定芽最適繼代培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg·L^-1+NAA0.5mg.L^-1。

2.4 不定芽的生根

從表4可以看出，處理4、5和6的生根率和平均根數(shù)都較高，且它們?cè)?.01水平上差異不顯著，但與其他6個(gè)處理在0.01水平上差異顯著。由R分析可知，生根率的最佳組合為：1／2MS+蔗糖30g·L^-1+IBA2.5mg·L^-1，平均根數(shù)的最佳組合為：1／2MS+蔗糖30 g·L^-1+IBA0.5mg·L^-1，與處理6相吻合；影響生根率因素的主次順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基>IBA>蔗糖，影響平均根數(shù)因素的主次順序?yàn)椋夯九囵B(yǎng)基>蔗糖>IBA，可見(jiàn)，影響鴨梨生根最主要的因子是基本培養(yǎng)基，其次是IBA和蔗糖。處理6根部產(chǎn)生的愈傷組織明顯少于其他處理，而愈傷組織多則不利于鴨梨組培苗移栽成活。所以確定不定芽最適生根培養(yǎng)基為1／2MS+蔗糖30g·L^-1+IBA0.5 mg·L^-1。

3 討論

有研究表明，基本培養(yǎng)基的種類對(duì)梨葉片再生有著重要的影響，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。研究結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基NN69更適于誘導(dǎo)鴨梨葉片愈傷組織產(chǎn)生不定芽，其再生頻率和再生芽數(shù)分別高達(dá)80.00％和1.77，與孫清榮等的報(bào)道一致。鴨梨不定芽在MS培養(yǎng)基中增殖、繼代生長(zhǎng)效果更好。在1／2MS培養(yǎng)基中生根效果好于MS、ASH培養(yǎng)基，高疆生等也曾獲得過(guò)類似的研究結(jié)果。可見(jiàn)，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的選擇合適的基本培養(yǎng)基是決定梨葉片再生成敗的一個(gè)十分重要的因素。

植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類及其配比不僅是影響果樹(shù)葉片培養(yǎng)成功與否、再生率高低的關(guān)鍵因素，而且還決定著愈傷組織的分化方向ll引。筆者在誘導(dǎo)鴨梨葉片愈傷組織生長(zhǎng)不定芽和不定芽生根過(guò)程中，曾采用的生長(zhǎng)素／細(xì)胞分裂素比值過(guò)高，而出現(xiàn)過(guò)只長(zhǎng)根，不長(zhǎng)芽，或不定芽的長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于根的現(xiàn)象。這與胡影等㈣的發(fā)現(xiàn)極其相似。本試驗(yàn)結(jié)果表明，BA3.0mg·L^-1與IAA0.5mg·L^-1組合有利于鴨梨葉片愈傷組織產(chǎn)生不定芽，而孫清榮等認(rèn)為T(mén)DZ2.0mg·L^-1與IBA0.5～0.7mg·L^-1組合可獲得較高的鴨梨的芽變品種大鴨梨不定芽再生率，這可能由基因型、培養(yǎng)條件如pH、光強(qiáng)、光質(zhì)等不同所致，尤其是光質(zhì)的影響，還有望進(jìn)一步深入研究。

在培養(yǎng)基組分中，蔗糖不僅是必需的碳源，同時(shí)還會(huì)起到滲透調(diào)節(jié)的作用。湯浩茹等在研究培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)不同梨基因型試管苗生根的影響時(shí)，曾添加了少量(5.0～15.0g·L^-1)蔗糖，即獲得了75％～100％的生根率。而在本研究中，發(fā)現(xiàn)添加30g·L^-1蔗糖鴨梨不定芽生根效果最好，這與徐凌飛等的報(bào)道相一致。

全國(guó)落葉果樹(shù)病蟲(chóng)害防治技術(shù)研討會(huì)在河南洛陽(yáng)召開(kāi)

2010年3月26-28日，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所主辦的全國(guó)落葉果樹(shù)病蟲(chóng)害防治技術(shù)研討會(huì)在河南洛陽(yáng)河南省金水灣大酒店召開(kāi)，鄭州果樹(shù)研究所副所長(zhǎng)方金豹、果樹(shù)所副所長(zhǎng)程存剛、洛陽(yáng)市農(nóng)業(yè)局局長(zhǎng)徐龍欣到會(huì)祝賀。會(huì)議邀請(qǐng)了國(guó)家現(xiàn)代蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室主任曹克強(qiáng)教授、國(guó)家現(xiàn)代梨產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室主任王國(guó)平教授、國(guó)家現(xiàn)代桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室主任張帆研究員、國(guó)家現(xiàn)代葡萄產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室主任王忠躍研究員、澳大利亞環(huán)球科技有限公司首席科學(xué)家Stephen Sexton做大會(huì)報(bào)告，國(guó)家現(xiàn)代蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室崗位專家陳漢杰研究員、孫廣宇教授、國(guó)立耘教授、李保華教授及國(guó)家現(xiàn)代桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室崗位專家李國(guó)懷教授等參加了會(huì)議。全國(guó)來(lái)自近20個(gè)省市自治區(qū)的160多名果樹(shù)植保專家和企業(yè)代表參加了本次大會(huì)，會(huì)議主題是“生產(chǎn)安全果品、促進(jìn)人類健康”。

本次學(xué)術(shù)會(huì)議征集到近年來(lái)我國(guó)果樹(shù)植保科技的新成果及新技術(shù)、新農(nóng)藥的示范推廣、農(nóng)林有害生物的發(fā)生與控制等內(nèi)容的論文60余篇，與《果農(nóng)之友》編輯部合作，正式出版了全國(guó)落葉果樹(shù)病蟲(chóng)害防治技術(shù)研討會(huì)論文集。研討會(huì)通過(guò)大會(huì)報(bào)告、分組報(bào)告、分組討論等多種形式進(jìn)行了交流．有效地推動(dòng)了果樹(shù)植保工作者相互交流經(jīng)驗(yàn)．展示研究新進(jìn)展、新技術(shù)、新方法、新成果。

會(huì)議閉幕式由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所王志強(qiáng)副所長(zhǎng)主持，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所副所長(zhǎng)程存剛做了大會(huì)總結(jié)。會(huì)議達(dá)到了預(yù)期的目的，并決定以后每2年舉辦一次。

這次學(xué)術(shù)會(huì)議雖然時(shí)間短，但內(nèi)容豐富、熱烈有序。本次會(huì)議為落葉果樹(shù)植保領(lǐng)域的科技工作者、相關(guān)學(xué)科的人員相互交流搭建了高質(zhì)量學(xué)術(shù)平臺(tái)，與會(huì)代表深感收獲甚多。本次學(xué)術(shù)會(huì)議的成功召開(kāi)，促進(jìn)了落葉果樹(shù)植保科技事業(yè)的發(fā)展與植保學(xué)科的繁榮。

涂洪濤(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所450009)