普通枇杷種內(nèi)和種間雜種苗的RAPD鑒定

摘要：枇杷同其他木本果樹(shù)一樣，遺傳上是高度雜合的，因此，獲得真雜種是進(jìn)行雜交育種等遺傳改良的重要基礎(chǔ)工作。以我國(guó)的特早熟優(yōu)質(zhì)枇杷品種早鐘6號(hào)作母本，分別以西班牙的3個(gè)大果型品種作父本進(jìn)行種內(nèi)雜交；并以櫟葉枇杷為母本與普通枇杷的解放鐘作父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，4個(gè)雜交組合(ZJ、ZU、zP和Li)共獲得493株雜種苗。運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記，對(duì)這些雜交苗進(jìn)行早期雜種鑒定，根據(jù)有無(wú)父本的特征帶或新帶型來(lái)鑒定其是否雜交成功，4個(gè)組合從100條RAPD引物中共計(jì)篩選出9條具有父本特征帶的引物，鑒定454株雜種苗為真雜種。試驗(yàn)獲得的真雜種苗可為枇杷品種的選育提供重要資源。

關(guān)鍵詞：枇杷：RAPD；雜種鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S667.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1009-9980f2010103-385-06

許多果樹(shù)在雜交選育新品種時(shí)常常因品種間串粉、去雄或套袋不及時(shí)等因素，造成真假雜種苗混雜。在實(shí)際工作中可以利用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子標(biāo)記等方法進(jìn)行雜種苗的鑒定。每種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。形態(tài)學(xué)標(biāo)記的主要缺點(diǎn)是易受環(huán)境條件和發(fā)育狀態(tài)的影響：細(xì)胞學(xué)鑒定雜種工作量大，也比較煩瑣；分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，為我們提供了從DNA水平即基因水平上來(lái)檢測(cè)種子純度的有利工具，最終通過(guò)電泳圖譜檢測(cè)差異性，其多態(tài)性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高。RAPD標(biāo)記為顯性，對(duì)雜種的鑒定可以根據(jù)有無(wú)父本的特征帶或在雜交后代中出現(xiàn)雙親所不具有的條帶(即新帶型)鑒定其是否雜交成功I引。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，理論上每個(gè)標(biāo)記只能鑒定出50％的雜種，這樣標(biāo)記Ⅰ(50％)十標(biāo)記Ⅱ(25％)+標(biāo)記Ⅲ(12.5％)+標(biāo)記Ⅳ(6.25％)=93.75％，4個(gè)標(biāo)記便可將F₁代群體中93.75％的雜種鑒定出來(lái)。由于RAPD的顯性遺傳特點(diǎn)，在用雙親進(jìn)行引物篩選時(shí)無(wú)法判斷父本特征位點(diǎn)是否為純合位點(diǎn)，有可能出現(xiàn)母本的顯性位點(diǎn)，故分析時(shí)必須結(jié)合多個(gè)RAPD標(biāo)記(不少于3個(gè))進(jìn)行分析。新帶型是在雜交后代中出現(xiàn)而在雙親中均沒(méi)有的條帶，在真假雜種鑒定時(shí)我們直接判斷其為真雜種。

宋愛(ài)云等利用RAPD技術(shù)對(duì)香樟6個(gè)優(yōu)選株和2個(gè)普通株的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，確定了它們的遺傳關(guān)系。劉靜等綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在石斛屬植物中的應(yīng)用研究，認(rèn)為RAPD是研究石斛屬植物的遺傳多樣性真?zhèn)蔚挠行Х椒āraham等在分析英、美、荷蘭等國(guó)家不同育種草莓組培苗時(shí)提出：親本的選配要選擇遺傳距離較大的材料，才有利于體現(xiàn)雜交優(yōu)勢(shì)。RAPD標(biāo)記被認(rèn)為是進(jìn)行枇杷雜種鑒定的一種簡(jiǎn)單、快速有效的方法。

枇杷屬于薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya)，種質(zhì)資源豐富，原產(chǎn)我國(guó)的枇杷屬植物有21個(gè)種(包括5個(gè)變種或變型)，栽培品種的枇杷為普通枇杷(E.japonica Lindl.)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培馴化及選育，形成了許多各具特色的品種。世界上幾個(gè)主要的枇杷生產(chǎn)規(guī)模較大或科研較先進(jìn)的國(guó)家，在品種資源上形成了各自的特色。中國(guó)的枇杷品種資源最豐富，有黃肉品種200多個(gè)和白肉品種100多個(gè)；日本主要是黃肉枇杷品種，不足100個(gè)品種，然而雜交育成的品種占有較大比例，品質(zhì)較好：西班牙也主要是黃肉品種，也不足100個(gè)，但西班牙有若干個(gè)果實(shí)較大的品種，其中3個(gè)品種的平均單果質(zhì)量都超過(guò)90g，其大果性在國(guó)際枇杷上獨(dú)占鰲頭。

我們選用我國(guó)特早熟優(yōu)質(zhì)的早鐘6號(hào)枇杷和3個(gè)大果型西班牙品種雜交，以及用櫟葉枇杷和普通枇杷中的解放鐘進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，共獲得4個(gè)雜交組合(ZJ、ZU、ZP和Lj)，共計(jì)有493株雜種苗，采用RAPD標(biāo)記對(duì)這些雜種苗進(jìn)行早期鑒定。研究在聚合不同國(guó)家枇杷品種的優(yōu)良特性方面，在遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新種質(zhì)方面：以及在利用分子標(biāo)記早期鑒定雜種以期提高枇杷雜交育種的效率等方面，都具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

2004年12月份進(jìn)行了普通枇杷種內(nèi)的3個(gè)組合的雜交和櫟葉枇杷×普通枇杷1個(gè)組合的雜交，雜交按常規(guī)方法進(jìn)行。次春收獲種子播種獲得雜種苗。雜交的3個(gè)群體即早鐘6號(hào)×西班牙品種Javierin(ZJ)雜種苗共計(jì)202株、早鐘6號(hào)xUllera(ZU)雜種苗共計(jì)94株、早鐘6號(hào)xPeHuches(ZP)雜種苗共計(jì)83株、櫟葉枇杷×解放鐘(Li)雜種苗共計(jì)114株。

1.2 方法

1.2.1 雜交實(shí)驗(yàn) 雜交選取枇杷盛花期含苞待放的花蕾，每穗留花10-15朵，去除雄蕊，將收集的父本的花粉點(diǎn)在母本的柱頭上，授粉后用雙層紙袋隔離，待幼果成型去掉外面一層，里面一層保留至果實(shí)成熟。

1.2.2 枇杷基因組DNA的提取枇杷基因組DNA的提取參照劉月學(xué)等…J和喬燕春等的方法。

1.2.3 RAPD體系和擴(kuò)增程序參照楊向暉和吳錦程等㈣的方法，25μL的反應(yīng)體系中，Mg²⁺為2.0mmol·L^-1，酶為1.0U，引物為0.2μmol·L^-1，dNTPS為0.10mmol·L^-1；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃5min(預(yù)變性)；94℃40s(變性)→38℃1 min(復(fù)性)→72℃1min(延伸)(45個(gè)循環(huán))；72℃10min(后延伸)。

2 結(jié)果9分析

2.1 RAPD引物篩選

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取100條能在枇杷上擴(kuò)增產(chǎn)生多態(tài)性的RAPD引物，進(jìn)一步對(duì)早鐘6號(hào)、Javierin、Pel-luches、Ullera、櫟葉枇杷和解放鐘6個(gè)親本的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)3次重復(fù)，篩選出能在Javierin、Pelluches、Ullera和解放鐘4個(gè)父本中穩(wěn)定擴(kuò)增的特征帶共計(jì)9條引物，引物序列見(jiàn)表1。

2.2 4個(gè)組合RAPD擴(kuò)增圖樣

2.2.1 早鐘6號(hào)~Javierin F，代群體鑒定 從100條RAPD引物中篩選出具有父本Javienn特征帶的引物，分別為G16、AB04、AVl9、BC20和BE02，進(jìn)一步對(duì)202株早鐘6號(hào)和Javiefin的雜交后代進(jìn)行擴(kuò)增，最后有28株雜交苗無(wú)法確定是否為真雜種：其余的鑒定為真雜種，真雜種率為86.2％。圖1和圖2分別是引物G16和AB04的部分?jǐn)U增結(jié)果。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲得的結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以作為鑒定真雜種的依據(jù)。

2.2.2 早鐘6號(hào)×Ullera F₁代群體鑒定

從100條RAPD引物中篩選出具有父本Ullera特征帶的引物AC06、G16、AB04、AVl9、BC20對(duì)94株早鐘6號(hào)和Ullera的雜交后代進(jìn)行了擴(kuò)增，最后有9株雜交苗無(wú)6號(hào)和Pelluches的雜交后代進(jìn)行擴(kuò)增，編號(hào)為6的雜交苗無(wú)法確定是否為真雜種：在擴(kuò)增的譜帶中還發(fā)現(xiàn)雙親都沒(méi)有，而在后代66號(hào)和68號(hào)中出現(xiàn)的新帶型，在雜種鑒定中，新帶型的出現(xiàn)更能直觀(guān)反映真雜種的鑒定情況，但這類(lèi)帶型出現(xiàn)的幾率較小，不能作為真雜種鑒定的主要研究手段。結(jié)合父本特征帶和新帶型的結(jié)果，真雜種率為98.8％。圖4是AC06的鑒定情況。經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可靠。

2.2.4 櫟葉×解放鐘F₁代群體鑒定 櫟葉枇杷和解放鐘雜交組合為種間雜交，親本之間差異較大，篩選父本解放鐘的特征帶較為容易，本研究?jī)H篩選20條引物，獲得具父本特征帶的引物F05、F06，且這2個(gè)引物擴(kuò)增獲得的父本特征帶均為純合顯性位點(diǎn)即AA型，AA型的位點(diǎn)是進(jìn)行雜種鑒定最為理想的位點(diǎn)，這類(lèi)型位點(diǎn)在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的親本間出現(xiàn)頻率較高，圖5為引物F05對(duì)114株Lj組合雜交后代的鑒定情況，圖中可以看出，引物F05在父本解放鐘中有多個(gè)位點(diǎn)為純合顯性位點(diǎn)，經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果穩(wěn)定可靠，進(jìn)一步利用引物F06進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的鑒定結(jié)果較為一致。114株雜交苗均為真雜種，真雜種率為100％。

3 討論

常規(guī)雜種鑒定有形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定等方法，陳志堅(jiān)等利用錘度具有高度可遺傳的品質(zhì)特性，對(duì)22個(gè)甘蔗家系F₁群體材料進(jìn)行了雜種鑒定。然而木本果樹(shù)童期長(zhǎng)，雜種后代幼苗在形態(tài)上很難區(qū)分；利用細(xì)胞學(xué)鑒定，雜交后代的染色體數(shù)目相同不能直接識(shí)別，通過(guò)基因組原位雜交技術(shù)可以進(jìn)一步解決，陳春麗等利用基因組原位雜交技術(shù)對(duì)屬間雜種枳橙進(jìn)行了有效的鑒定。盡管原位雜交技術(shù)獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為直觀(guān)，但耗時(shí)較長(zhǎng)，花費(fèi)較高，不適于大量材料的雜種鑒定。由于RAPD分子標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定，不受環(huán)境變化、發(fā)育階段和組織器官的影響，具有較高的穩(wěn)定性、而且操作簡(jiǎn)便，近年來(lái)RAPD分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用在許多作物的雜種鑒定中，欒雨時(shí)等利用RAPD分子標(biāo)記鑒定了番茄雜種的純度，獲得的結(jié)果可快速的應(yīng)在番茄育種中。本試驗(yàn)利用RAPD技術(shù)對(duì)3組種內(nèi)雜種和l組種問(wèn)雜種的雜交苗進(jìn)行了早期鑒定，檢測(cè)的方法主要是父本遺傳信息滲入到后代中，或存后代中出現(xiàn)新帶型(雜交后代中有而雙親無(wú)的帶型)，我們就可斷定此F，代單株為雜種實(shí)生苗。南于RAPD的顯性遺傳特點(diǎn)，在用雙親進(jìn)行引物篩選時(shí)無(wú)法判斷父本特征位點(diǎn)是否為純合位點(diǎn)，故分析時(shí)必須結(jié)合多個(gè)RAPD標(biāo)記(一般為3～5個(gè))進(jìn)行綜合分析。父本特征帶的基因型為AA或者Aa時(shí)，特征帶在后代中出現(xiàn)分離則可判斷其為Aa，不出現(xiàn)分離則為AA。用AA型的父本特征帶進(jìn)行真假雜種鑒定，可以達(dá)到只用一個(gè)引物就可以鑒定出所有真假雜種的效果，如櫟葉和解放鐘雜交群體用引物F05就可以將114株雜種鑒定出來(lái)。而在雜交后代中出現(xiàn)新帶型的機(jī)率并不高，因此鑒定雜種是否為真雜種主要以出現(xiàn)父本的特征帶為主，一旦出現(xiàn)雜交后代有而雙親無(wú)的特征帶，我們直接判斷其為真雜種。

本研究結(jié)果對(duì)于枇杷遺傳改良具有多方面的意義。首先，利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)枇杷種內(nèi)雜交和種間雜交進(jìn)行早期快速鑒定和識(shí)別，是枇杷雜交育種的有效輔助手段；第二，枇杷樹(shù)體較大，種植雜種苗需要很多的土地。利用有限的土地種植真正的雜種苗，既提高效率又節(jié)約土地；第三，鑒別出真正的雜種苗，可以為創(chuàng)建枇杷分子遺傳圖譜的作圖群體，提供可靠的基礎(chǔ)。關(guān)于創(chuàng)建枇杷分子遺傳圖譜的結(jié)果另文報(bào)道。

4 結(jié)論

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)4個(gè)雜交組合(ZJ、ZU、ZP和Li)獲得的493株雜種苗進(jìn)行了早期雜種鑒定。從100條RAPD引物中共計(jì)篩選出9條具有父本特征帶的引物，鑒定出真雜種苗454株。本研究利用西班牙的大果型枇杷和我國(guó)選育的優(yōu)質(zhì)早熟的早鐘6號(hào)枇杷雜交，以期獲得適合我國(guó)栽培的優(yōu)質(zhì)早熟的大果型枇杷品種：利用野生櫟葉枇杷和解放鐘枇杷雜交，使野生資源中的優(yōu)異基因源向栽培品種轉(zhuǎn)化，進(jìn)而獲得抗逆性強(qiáng)的栽培品種。本試驗(yàn)獲得的真雜種苗為進(jìn)一步枇杷品種的選育提供重要資源。