植物中重要的信號分子——CaM

摘要:鈣調(diào)素(CaM)作為最重要的一類Ca2+結(jié)合蛋白，在信號傳導過程中具有重要作用，從CaM結(jié)構(gòu)、亞型、分布、作用原理、生理功能、基因表達及CaM相關(guān)蛋白幾個方面進行簡要闡述。

關(guān)鍵詞:鈣調(diào)素;亞型;作用原理;生理功能;基因表達;CaM相關(guān)蛋白

中圖分類號:S322.1文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.03.010

Important Signal Molecular in Plants——CaM

HUO Jian-fei， LIU Chun-yan， HAO Yong-juan， WANG Yong， WANG Wan-li

(Tianjin Plant Protection Institute， Tianjin 300112， China)

Abstract:Calmodulin(CaM) is the most important calcium-binding protein， it plays important role in signal transduction process. CaM instructure， isoforms， distribution， function principle， physiological functions， gene expression and CaM binding proteins in this article were introduced.

Key words: CaM; isoforms; function principle; physiological functions; gene expression; CaM binding proteins

鈣調(diào)素( Calmodulin， CaM)是一種分布最廣，功能最重要的鈣依賴性調(diào)節(jié)蛋白。它是1964年美籍華人張槐耀在研究細胞內(nèi)cAMP的濃度變化中環(huán)腺苷酸磷酸二酯酶(PDE)的調(diào)節(jié)作用時發(fā)現(xiàn)的，不同的研究者根據(jù)自己的實驗結(jié)果而有不同的名稱，中國于1987年徐州會議定名為鈣調(diào)素[1]。它廣泛存在于真核細胞中，是一種以Ca2+受體形式參與細胞中多種酶及許多鈣依賴性生理調(diào)節(jié)過程、能調(diào)節(jié)細胞生長、分化甚至轉(zhuǎn)化的極為重要的多功能蛋白質(zhì)[2]。

1CaM的結(jié)構(gòu)

鈣調(diào)素是細胞溶質(zhì)中具有148個氨基酸的蛋白，它調(diào)制大多數(shù)Ca2+的調(diào)節(jié)功能。鈣調(diào)素的鏈由4個區(qū)域(I~IV)組成，每個區(qū)域結(jié)合一個Ca2+。每個結(jié)合位置由包含天冬氨酸和谷氨酸側(cè)鏈的環(huán)組成，側(cè)鏈與Ca2+形成離子鍵。蘇氨酸、酪氨酸和天冬酰胺側(cè)鏈上的氧原子也參與和Ca2+的結(jié)合(引自張槐耀)。CaM在進化過程中具高度保守性，所有哺乳動物的鈣調(diào)素有90%的氨基酸序列相似性，植物鈣調(diào)素與脊椎動物和酵母的氨基酸序列相似性分別為91%和84%，與藻類的相似性為84%~100%。CaM的分子量為16 700，具有較好的熱穩(wěn)定性，酸性和保守性，其中1/3是帶有側(cè)鏈的谷氨酸和天冬氨酸，但不含胱氨酸和脯氨酸，具疏水性，與Ca2+結(jié)合后分子構(gòu)象發(fā)生改變，由啞鈴狀變?yōu)榍驙睿珻aM的疏水區(qū)呈激活態(tài)，與無活性依賴于CaM介導的酶相互作用，其構(gòu)象進一步發(fā)生改變，增加催化活性。Ca2+-CaM是CaM的活化形式，它能調(diào)節(jié)幾十種酶的活性。

2CaM的亞型

脊椎動物中有多種CaM 基因，但它們編碼的CaM 蛋白具有完全一致的氨基酸序列，而在植物中發(fā)現(xiàn)的多種CaM 基因，它們編碼相同或相似的蛋白，這些蛋白都具有EF-手型Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，都能夠與Ca2+結(jié)合，因此，將這些CaM及其相似蛋白稱為CaM亞型(isform)[3，4]。這些 CaM 亞型在植物生長發(fā)育過程中以及對不同刺激信號的反應(yīng)中的基因表達狀況不同。CaM亞型的氨基酸組成變化可能使其與不同的靶蛋白相互作用，從而完成不同的生物學功能。植物中多種CaM亞型的存在進一步增強了Ca2+信號介導的信號網(wǎng)絡(luò)的多樣性和復雜性。

到目前為止，在不同植物中已分別克隆到多種CaM基因，植物體中廣泛存在CaM多基因家族已是不容置疑的事實。擬南芥中CaM亞型是最早得到克隆的，至少已經(jīng)克隆到 10 個CaM基因[5-8]，馬鈴薯[9]、大豆[10]、小麥[11]中分別分離鑒定了8個、5個、10 個CaM基因。另外，在玉米[12]、豌豆[13]等中都克隆到了不同的CaM多基因家族。其中，以馬鈴薯和大豆的植物CaM多基因研究較為深入。

Takeawa等[9]分析馬鈴薯中8個CaM基因(PCM1~PCM8)的結(jié)構(gòu)表明，PCM1、5、7和8與通常的CaM基因一樣， 均含有2個外顯子及1個內(nèi)含子(1.5~2.7 kb); 而PCM2、3、4和6則沒有第一個外顯子。比較8種基因的編碼區(qū)表明，這些基因序列高度保守，而在5'和3'非編碼區(qū)則存在很大的差異。從比較根據(jù)基因推斷出的蛋白序列來看，PCM5、6、7、8 的序列完全相同，且和擬南芥的ACAM-2以及大麥CaM-1編碼的蛋白十分相似;PCM-1則含有特殊的氨基酸序列，特別是在第四個Ca2+結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與其它幾種不同，但與雞CaM的第四個Ca2+結(jié)合區(qū)完全相同。Lee等[10]用水稻的CaM基因為探針，從4 d齡的大豆黃化苗下胚軸組織制備的cDNA文庫中克隆到5個CaM的cDNA(SCaM1~SCaM-5)，比較推斷的氨基酸序列表明，SCaM-1、SCaM-3編碼相同的氨基酸序列;SCaM1、SCaM-2編碼蛋白在N端相差2個氨基酸;SCaM-4、SCaM-1編碼氨基酸相差32個;SCaM-5、SCaM-1編碼氨基酸相差33個;SCaM-5、SCaM-4編碼氨基酸相差15個。可見SCaM-4和SCaM-5編碼的蛋白和SCaM-1編碼蛋白相比具有很大的差異。

3CaM的分布

CaM廣泛地分布于幾乎所有已知的真核生物中，但在不同組織、器官和原生質(zhì)體中它的含量不同，分布也不一樣。細胞內(nèi)CaM的水平最終是由胞內(nèi)Ca2+濃度控制的，胞內(nèi)靜息態(tài)Ca2+濃度為10-7 mol/L，當胞內(nèi)濃度高于10-5 mol/L時，Ca2+則結(jié)合CaM。CaM和CaM mRNA在培養(yǎng)細胞的分生群體和植物分生組織中分布最多。如:在花粉管的萌發(fā)過程中，花粉管和柱頭中CaM含量最高。大麥葉片的分生組織、頂端分生組織中CaM mRNA的含量增加[14，15]。CaM mRNA在雌蕊正在發(fā)育過程中的細胞核和核仁中大量表達，特別是在核仁中的表達最多。在成熟植物細胞的細胞質(zhì)和細胞核中，CaM mRNA的表達量一致，CaM蛋白在細胞質(zhì)中的表達卻高于細胞核中的表達[16-18]。趙潔等[19]在研究小麥分離合子與幼胚的發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，在不同的胚期CaM分布不一樣，較大的梨形期，胚體較胚柄含量高，剛分化出胚芽鞘和胚芽時，基部的CaM含量很高。Yang等人[20]通過試驗發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育的種子中，鈣調(diào)素在胚乳中都有高水平的表達，而在糊粉層中有較低水平的表達;在植物的初生根中，鈣調(diào)素在根冠，分生組織中都有表達，而在根的發(fā)育過程中，其表達程度逐漸降低。

4CaM與Ca2+的結(jié)合及鈣調(diào)蛋白的作用原理

鈣調(diào)素是植物細胞中胞內(nèi)Ca2+最重要的多功能受體蛋白。鈣調(diào)素自身并沒有酶活性，只有其活化后進一步與其靶蛋白中的短肽序列結(jié)合，才能誘發(fā)其結(jié)構(gòu)變化，從而調(diào)控植物細胞分裂、伸長、生長、發(fā)育和抗逆等。CaM作用機理要點是:Ca2+與CaM結(jié)合而激活CaM，活化了的Ca2+ -CaM再與多種酶結(jié)合從而調(diào)節(jié)酶活力，最終引起生理生化反應(yīng)，繼而調(diào)控植物的細胞分裂、伸長、生長、發(fā)育和抗逆等[21，22]。

因此，同Ca2+的結(jié)合是CaM活化的重要條件。普遍認為CaM的四個Ca2+結(jié)合區(qū)中，N端的Ⅰ、Ⅱ區(qū)為低親和力區(qū)，C端的Ⅲ、Ⅳ區(qū)為高親和力區(qū)[23]，兩者的半飽和濃度分別是11.0 μmol/L及3.0 μmol/L，

高親和力區(qū)結(jié)合Ca2+會使低親和力區(qū)對Ca2+的親和力增加。進一步研究表明兩個成對的結(jié)合區(qū)之間(如Ⅰ、Ⅱ區(qū)之間)也存在協(xié)同作用[24]。通過對CaM溶液的晶體學分析和核磁共振研究可知道，CaM分子一端的兩個Ca2+結(jié)合手形結(jié)構(gòu)是相互關(guān)聯(lián)的，在這兩個結(jié)合區(qū)中，相互對應(yīng)的結(jié)合Ca2+環(huán)結(jié)構(gòu)的肽段之間形成了反平行的B-片層結(jié)構(gòu)，這樣二者之間不可避免地表現(xiàn)對Ca2+結(jié)合的協(xié)同性，即兩個手形結(jié)構(gòu)同時結(jié)合Ca2+時，對Ca2+的親和力要大大高于單獨一個手形結(jié)構(gòu)對Ca2+的親和力。這種協(xié)同性可能和CaM結(jié)合Ca2+的構(gòu)象變化有關(guān)。

由于完整的CaM分子兩端的EF手形結(jié)構(gòu)對Ca2+的親和力不同，結(jié)合了Ca2+的CaM分子N端Ⅰ、Ⅱ區(qū)中Ca2+的解離速率比C端的Ⅲ、Ⅳ區(qū)要快，所以，被Ca2+激活的完整的CaM分子很可能通過N端Ca2+的交換來敏感地反映環(huán)境中Ca2+的濃度變化，進而調(diào)節(jié)整個CaM分子對Ca2+的結(jié)合狀態(tài)，來完成激活向失活的轉(zhuǎn)化。CaM分子的整體的構(gòu)象變化是其執(zhí)行生理功能的必要條件。

5鈣調(diào)蛋白的生理功能

CaM生理功能的研究涉及面相當廣泛，在酶活、性調(diào)節(jié)、細胞分裂與分化、細胞骨架與細胞運動、光合作用、激素反應(yīng)、核內(nèi)酶系統(tǒng)及基因表達等生理過程中，都有參與。細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化作為一種重要的調(diào)節(jié)信號，對多種細胞代謝活動均具調(diào)控作用。細胞自由Ca2+的分布與轉(zhuǎn)移是形成Ca2+信號的基礎(chǔ)。當細胞接受環(huán)境刺激后，胞外鈣離子的涌入和胞內(nèi)鈣庫的釋放會使胞質(zhì)自由Ca2+濃度升高，升高后的Ca2+會啟動鈣信號途徑，激活CaM，CaM會進一步激活依賴的蛋白激酶(CaMK)或結(jié)合蛋白(CaMBPs)，蛋白激酶的活化會導致代謝的關(guān)鍵酶或轉(zhuǎn)錄因子活化，從而完成對細胞代謝活動或某些基因表達的調(diào)節(jié)[25]。

在植物生理學、植物病理學、細胞生物學、發(fā)育生物學研究中，Ca2+-CaM也一直是熱點。鈣-鈣調(diào)蛋白動態(tài)研究己涉及植物雌雄配子形成[26]、花粉管生長[27]、生殖核分裂[28]、藻類植物卵及合子極性建立[29]、助細胞退化[30]、幼胚發(fā)育中的極性分布[31]及種子萌發(fā)[32]等各個方面。Gong等[33]研究表明，Ca2+·CaM信使參與調(diào)節(jié)玉米幼苗中抗氧化酶活性而提高玉米幼苗抗熱性。張化生等[34]通過生理生化試驗證實了Ca2+·CaM系統(tǒng)在辣椒幼苗抗冷調(diào)控過程中起著重要作用。宗會等[35]用CPZ和LaCl3對水稻進行根際處理，阻礙Ca2+·CaM信號傳導后降低干旱、鹽和低溫脅迫下水稻幼苗存活率、RWC和相對生長量，同時增大其質(zhì)膜透性，表明Ca2+·CaM信使系統(tǒng)參與了水稻幼苗抗逆性調(diào)控。郭秀林等[36]通過試驗證實了干旱情況下ABA引起酶活性變化的過程中，Ca2+·CaM系統(tǒng)參與到其中，說明了CaM可能參與干旱信號引起基因表達的過程。張春梅等[37]通過試驗研究了鈣、鈣調(diào)素拮抗劑W-7預處理對聚乙二醇模擬干旱脅迫下番茄幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明鈣調(diào)素拮抗劑W-7浸種處理顯著提高了番茄幼苗MDA、H2O2含量和O2·產(chǎn)生速率，抑制了SOD、POD活性，加劇了AsA 和GSH的破壞;說明Ca2+-CaM信號系統(tǒng)對緩解番茄PEG脅迫具有重要作用。在植物病理學方面，近年來一些學者也對CaM的作用進行研究。霍建飛等[38]通過用CaCl2和CaM拮抗劑TFP、CPZ和W-7預處理小麥種子后，接種親和及非親和小麥葉銹菌后的結(jié)果表明:小麥葉片接種非親和性葉銹菌后，TFP、CPZ和W-7浸種處理抑制了POD、PAL、PPO和CAT活性的上升;小麥葉片接種親和性葉銹菌后，CaCl2預處理加劇了POD、PAL、PPO和CAT活性的上升，這說明Ca2+·CaM信使系統(tǒng)可能在小麥抗葉銹病過程中起著重要作用。陳貴華等[39]通過試驗也證實了Ca2+·CaM系統(tǒng)調(diào)控甜菜抗氧化酶活性，降低活性氧含量，提高了甜菜抗叢根病的能力，說明Ca2+·CaM系統(tǒng)與甜菜抗叢根病密切相關(guān)。在發(fā)育生物學中，邢樹平等[40]發(fā)現(xiàn)用CaM拮抗劑TFP 和CPZ 處理小麥種根，均對其產(chǎn)生抑制作用，添加一定濃度的外源CaM可消除這種抑制作用，表明小麥種根生長發(fā)育調(diào)節(jié)中的某些環(huán)節(jié)與Ca2+·CaM 系統(tǒng)有關(guān)。龔明等[41]也認為，CaM 可能對玉米胚胎發(fā)育過程中誘導胚根和胚芽的形成起重要作用。吳娟子等[42]發(fā)現(xiàn)，一定量的CaM 能促進細胞增殖、胚胎生長以及形態(tài)發(fā)生，10- 7 mol/L 和10- 8 mol/L CaM促進不同發(fā)育時期的水稻胚胎按正常胚胎發(fā)育途徑生長。李紅兵等[43]發(fā)現(xiàn)，胞外CaM有促進白芷懸浮細胞增殖的作用。邊艷青等[44]發(fā)現(xiàn)外源CaM可促進白芷原生質(zhì)體壁再生和第一次分裂。Grangwani等[45]發(fā)現(xiàn)，CaM可激活從浮萍屬植物中得到的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶的活性。Preisig等[46]發(fā)現(xiàn)在煙草的植物抗毒素合成中也有CaM的參與，這些都表明了CaM的生理作用是一個廣闊的研究領(lǐng)域。

6CaM基因的表達

通過對CaM和CaM相關(guān)(CaM-related)基因的研究，可以直接或間接地說明CaM在生理過程中的作用。不同的物理和化學信號可以誘導出對應(yīng)于CaM和CaM相關(guān)(CaM-related)基因的不同的mRNA。Jena等[47]用馬鈴薯CaM cDNA做探針，分別研究了在生長素敏感的草莓果實和光敏感的玉米根部中生長素和光信號對CaM基因表達的影響。生長素處理過的草莓果實同對照相比CaM mRNA水平升高，而且將暗處生長的玉米根尖暴露至光下也使CaM mRNA水平有所增加。Braam[48]在對擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，觸摸、風、雨、傷害刺激可迅速(10~30 min內(nèi))誘導出對應(yīng)于4種不同的CaM cDNA(TCH1，TCH2，TCH3，TCH4)的mRNA。傷害同樣可以誘導蘋果CaM基因的表達。另外的研究表明觸摸和風信號能提高細胞質(zhì)Ca2+濃度，而且Ca2+可以調(diào)控一些觸摸基因的表達。因此，觸摸信號傳導的可能過程首先是細胞質(zhì)Ca2+濃度升高，進而它可順次地調(diào)控特定基因的表達，當然也包括編碼它的受體——CaM的基因[49]。可見，至少在某些信號的傳導過程中，調(diào)幅機制和調(diào)敏機制是協(xié)同作用的，即首先由于細胞內(nèi)Ca2+增加而通過調(diào)幅機制起作用，接著由于Ca2+增加引起CaM基因的表達使CaM增加，調(diào)敏機制開始作用，從而完成一個信號傳導所產(chǎn)生的完整的生理變化。

CaM基因表達還具有亞型特異性。Takezawa等[50]通過試驗證實，發(fā)育過程中不同器官中的CaM亞型基因的表達有差異。根尖中PCaM1、5、8表達最高，其次是芽，再次是根，葉中表達最低。PCaM 6 mRNA在各種組織中均穩(wěn)定表達，而在葉中表達最低。PaCM 4 m R N A 在各種組織中的含量都非常低。在實驗中均未檢測到P Ca M 2 、3 mRNA的存在，推測這兩個基因可能在某些特殊的組織或器官中表達。Lee等[51]通過試驗證實SCaM-1、SCaM-2 表現(xiàn)出相同的表達水平，二者在所檢測的組織和器官中均有表達;SCaM-3 與SCaM-1、SCaM-2 具有相似的表達模式，但是在胚軸尖端表達量較低;SCaM-4 在下胚軸尖端和伸長區(qū)有表達，但表達的量比SCaM-1 低5 倍，在成熟組織中二者表達相同，表達量均非常低，而在SCaM-1 豐富表達的根中SCaM - 4 幾乎不表達。這表明SCaM-1 、SCaM-2 和SCaM-3 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可能相同，SCaM-4 則屬于完全不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Duval等[52]從萌發(fā)豌豆種子中鑒定了3個CaM亞型(PsCaM1~3)，在種子萌發(fā)過程中3 種基因具有不同的表達模式。由此可見，在植物生長發(fā)育及不同刺激條件下，CaM基因表達的差異表明不同的CaM 亞型介導各自特異的信號轉(zhuǎn)導途徑。

7CaM相關(guān)蛋白

Ca2+-CaM信號途徑要通過CaM相關(guān)蛋白來實現(xiàn)。植物中CaM由多個基因編碼，不同器官、不同細胞有不同的表達形式。同時不同的CaM異構(gòu)體與不同的靶蛋白結(jié)合[53，54]。Ca2+與CaM的結(jié)合引起異構(gòu)體的改變暴露出疏水區(qū)域后與靶蛋白結(jié)合[55，56] ，由于靶蛋白、CaM表達形式的不同產(chǎn)生了體內(nèi)Ca2+信號途徑的多樣性。這些靶蛋白可分為:(1)蛋白酶類;(2)鈣泵;(3)核作用因子。那么分離和確定真核生物中CaM結(jié)合蛋白(Calmodulin-binding proteins， CaMBPs)對于理解Ca2+-CaM介導的信號轉(zhuǎn)導無疑具有重大的意義。CaMBPs的CaM結(jié)合區(qū)域不具保守性。Berridge[57]、Collins等[58]主要運用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用生物化學和分子生物學的方法確定了CaMBPs。用此方法己確定了很多與植物形態(tài)建成，細胞分裂，細胞延長，離子運輸，基因調(diào)控，細胞骨架形成，胞質(zhì)環(huán)流，花粉管伸長和脅迫誘導有關(guān)的一些CaMBPs。

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