α-地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)進(jìn)展

【摘要】地中海貧血(thalassaemias)，是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血，但并不涉及血紅蛋白結(jié)構(gòu)的異常。是人類最常見的單基因遺傳病。總結(jié)近年α-地中海貧血實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，為提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性，減少誤診和漏診，需要要已有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合應(yīng)用，開陳出新，盡力創(chuàng)造最為適合患者診斷的實(shí)驗(yàn)手段。

【關(guān)鍵詞】α-地中海貧血;實(shí)驗(yàn)室診斷;篩查法;基因診斷

【中圖分類號(hào)】R446【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)10-030-2

地中海貧血(thalassaemias)，是由于某類珠蛋白合成受抑制所引起的溶血性貧血，但并不涉及血紅蛋白結(jié)構(gòu)的異常。是人類最常見的單基因遺傳病。地中海貧血共有α、β、γ、δ等幾種亞類。其中α-地中海貧血最為常見。α-地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血[1]。α-地中海貧血臨床表現(xiàn)與α-珠蛋白鏈的合成減少的程度相關(guān)，輕癥者可無臨床癥狀或僅有輕微的血液學(xué)改變，中間型者為HbH病，有輕至中度貧血，肝脾腫大，黃疸等，重癥者為血紅蛋白Bart’s胎兒水腫綜合征，胎兒常于妊娠晚期(30-40周)死亡或早產(chǎn)后數(shù)小時(shí)死亡。α-地中海貧血主要見于東南亞和地中海地區(qū)，美國黑人，印度次大陸亦相當(dāng)常見。在我國則以南方地區(qū)多見，如廣西、廣東、四川、云南等地。因α-地中海貧血的高發(fā)病率及重癥者新生兒死亡，故適當(dāng)?shù)尼槍?duì)α-地中海貧血的診斷具有重大的現(xiàn)實(shí)意義，本文就α-地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)綜述如下:

目前實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)主要有篩查法和基因診斷法兩種[2]:

1篩查法篩查法師實(shí)驗(yàn)室診斷α-地中海貧血的基本方法，具有實(shí)驗(yàn)方法簡便，造價(jià)低廉等特點(diǎn)。常見的篩查法包括:血常規(guī)測(cè)定和血紅蛋白分析。

1.1血常規(guī)測(cè)定:血液常規(guī)檢測(cè)(blood routine test)又稱血液一般檢測(cè)，包括紅細(xì)胞，白細(xì)胞及血小板參數(shù)檢測(cè)。是地中海貧血檢測(cè)的第一步，地中海貧血的重要特征之一是小紅細(xì)胞和低色素，因此重要的血液學(xué)指標(biāo)是紅細(xì)胞平均體積(MCV)及紅細(xì)胞平均血紅蛋白(MCH)。現(xiàn)今臨床診斷中應(yīng)用的地貧診斷MCV截?cái)嘀禐閲H地貧協(xié)會(huì)推薦使用的地貧篩查診斷截?cái)嘀担瑸镸CV<79fl和MCH<27pg[3]。

1.2紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。在良好的染色血涂片上，正常紅細(xì)胞的大小形態(tài)較為一致，染色淡紅色，中央著色較邊緣淺。地中海貧血可在血涂片上見紅細(xì)胞大小不均，異常紅細(xì)胞，靶形、球形、橢圓形紅細(xì)胞，多嗜色性紅細(xì)胞等。可根據(jù)紅細(xì)胞形態(tài)初步判斷地中海貧血。如HbH病的靶形紅細(xì)胞較多，紅細(xì)胞碎片少見。

1.3紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)。即測(cè)定紅細(xì)胞處于不同濃度的低滲鹽水溶液中，從開始溶血到完全溶血的界限，主要取決于紅細(xì)胞表面積與其體積比。因地中海貧血的紅細(xì)胞膜存在形態(tài)異常，故地中海貧血患者紅細(xì)胞脆性降低[4]。一些醫(yī)院使用紅細(xì)胞脆性一管定量法進(jìn)行α-地貧的篩查[5，6]。把平均紅細(xì)胞體積(MCV)測(cè)定法與紅細(xì)胞脆性一管法結(jié)合，對(duì)輕型地貧具有較好的篩查作用[4，7]。

1.4不穩(wěn)定血紅蛋白測(cè)定:(1)異丙醇沉淀試驗(yàn)，含不穩(wěn)定血紅蛋白的血標(biāo)本在加入異丙醇后很快渾濁，并形成絨毛狀沉淀。血紅蛋白H可出現(xiàn)陽性特征。(2)熱變性試驗(yàn)，根據(jù)不穩(wěn)定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性的特性，在50℃時(shí)對(duì)不穩(wěn)定血紅蛋白進(jìn)行篩查。α-地中海貧血時(shí)沉淀量偏高。本法敏感性不高，但特異性較異丙醇試驗(yàn)高。(3)紅細(xì)胞包涵體試驗(yàn)，不穩(wěn)定血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。變性珠蛋白包涵體對(duì)診斷α-地中海貧血HbH病是一項(xiàng)簡易、方便且特異性較高的方法，當(dāng)HBH含量較少使血紅蛋白電泳未見HbH區(qū)帶時(shí)，而可檢測(cè)包涵體為陽性。同時(shí)對(duì)α-地中海貧血1與α-地中海貧血2的診斷也有重要意義。

1.5血紅蛋白分析:診斷地中海貧血中的各種血紅蛋白，并對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析。(1)血紅蛋白電泳，因各種血紅蛋白均帶電荷，其等點(diǎn)電均在7以下，故在PH8.5的緩沖液中各種血紅蛋白均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下都向陽極運(yùn)動(dòng)，不同的血紅蛋白，其等電點(diǎn)不同，電泳速度不一，故可用電泳分離定性。應(yīng)用醋酸纖維薄膜作為電泳固相支持物，還可對(duì)電泳分離出的不同血紅蛋白進(jìn)行定量分析。(2)毛細(xì)管電泳(CE)，CE是一類以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)式樣中各組分之間的淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離、分析的新型液相分離技術(shù)。有分析速度快，靈敏度高，分辨率高，重現(xiàn)性好，樣本用量和試劑消耗少，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。但因CE儀器只能做單個(gè)樣本分析，其平均速度不能同醋酸纖維薄膜電泳相比。(3)高效液相色譜(HPLC)，現(xiàn)已用于定量分析血紅蛋白A2及抗堿血紅蛋白。(4)珠蛋白肽鏈聚丙烯酰胺凝膠電泳，用尿素將血紅蛋白解離成多肽鏈，通過聚丙烯酰胺電泳的電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，將各種肽鏈分離，形成不同的區(qū)帶，當(dāng)各種珠蛋白鏈的合成量或結(jié)構(gòu)發(fā)生異常時(shí)，其珠蛋白鏈區(qū)帶相互間的含量比例或電泳遷移率可出現(xiàn)與正常不同的改變，通過各區(qū)帶間含量比例的測(cè)定，可了解各珠蛋白基因表達(dá)的信息，可檢測(cè)出大部分的α-地中海貧血患者。

2基因診斷法隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，遺傳病的發(fā)生不僅與DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平的變化相關(guān)。基因診斷的探測(cè)目的物至少包括DNA和mRNA。因?yàn)棣?地中海貧血是由于α-珠蛋白基因缺失或缺陷使α-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血，大部分α-地中海貧血是由于α-基因缺失所致。故可運(yùn)用基因診斷法對(duì)α-基因進(jìn)行檢查。1983年Mullis建立PCR技術(shù)，多年來，這種技術(shù)在實(shí)際運(yùn)用中發(fā)揮了重要的作用，為遺傳病的診斷提供了更加可靠的依據(jù)[8-9]。

我國對(duì)地貧的基因診斷始于20世紀(jì)80年代初，先后經(jīng)歷了DNA點(diǎn)雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、限制性片段長度多態(tài)性(RFL P)連鎖分析、寡核苷酸(A SO)探針雜交和PCR體外基因擴(kuò)增等5個(gè)發(fā)展階段，特別是PCR及其相關(guān)發(fā)展技術(shù)，已成為最普遍的基因診斷方法。

2.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):PCR是利用DNA聚合酶等在體外條件下，催化一對(duì)引物間的特異DNA片段合成的基因體外擴(kuò)增技術(shù)。應(yīng)用血紅蛋白電泳檢測(cè)對(duì)血紅蛋白H病能進(jìn)行較好的診斷，但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)型和靜止型的α-地貧不能進(jìn)行有效診斷。以PCR為基礎(chǔ)的診斷方法已應(yīng)用于α-地貧的基因診斷[10，11]，并經(jīng)歷了單重[12]、雙重[13]至多重[14]幾個(gè)階段。

多重PCR它的特點(diǎn)是在一個(gè)PCR體系中包含4對(duì)等位基因特異引物。根據(jù)每個(gè)突變位點(diǎn)的特異擴(kuò)增帶來判斷結(jié)果。在診斷各種缺失型α-地中海貧血時(shí)，相對(duì)于傳統(tǒng)的Southern

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雜交技術(shù)，操作簡單，周期短，不使用放射性核素，便于臨床推廣[15]。

多重PCR已廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷，單管可同時(shí)對(duì)東南亞、左缺和右缺進(jìn)行檢測(cè)，特別是對(duì)靜止型的α-地貧可進(jìn)行有效檢測(cè)。

2.2Southern印記雜交法:鑒別DNA靶分子的雜交稱為Southern印記雜交，是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)待測(cè)DNA的一種方法。

2.3寡核苷酸(ASO)探針檢測(cè)法:ASO探針靈敏度高，可以分析樣品間的單個(gè)堿基變化，最早被用來做遺傳性疾病特定突變的檢測(cè)。本方法將待檢DNA樣品點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，然后與特定的ASO探針雜交，以檢測(cè)點(diǎn)突變或缺失引起的遺傳性疾病。此技術(shù)的缺點(diǎn)是必須嚴(yán)格控制雜交條件，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性或假陰性，另一缺點(diǎn)是成本高[17]。

2.4RFLP連鎖分析法:因突變導(dǎo)致限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)消失或形成，從而導(dǎo)致相應(yīng)的DNA酶切片段的改變，這在群體中表現(xiàn)為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)。當(dāng)探針跨越酶切位點(diǎn)時(shí)[16]，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列，也可以通過改變引物序列使擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生(或消失)酶切位點(diǎn)。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并電泳分離，從而檢測(cè)地貧基因。

2.5基因芯片:根據(jù)基因芯片上不同位置所出現(xiàn)的熒光位點(diǎn)顏色及強(qiáng)弱的變化來判斷地中海貧血的基因突變類型，與傳統(tǒng)方法比較，基因芯片診斷技術(shù)在核酸擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，采用熒光標(biāo)記及引物延伸的方法，可提高檢測(cè)結(jié)果的敏感性和特異性，由于基因芯片高通量特點(diǎn)，可將α、β地中海貧血基因診斷在一張芯片上完成，適用于大面積普查[18]。缺點(diǎn)是芯片造價(jià)成本較為高昂，還未能廣泛使用于臨床檢驗(yàn)。

近年隨著分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)迅猛發(fā)展，α-地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)亦隨之提高。大量的新技術(shù)，新方法被應(yīng)用于α-地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室診斷中。為做好實(shí)驗(yàn)室診斷，在篩查攜帶者、遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、選擇性流產(chǎn)等方面起到了重要作用。及早的防治地貧，直接關(guān)系到人民的健康。為使α-地中海貧血的診斷更方便、更快捷、更便宜，為提高地中海貧血診斷的準(zhǔn)確性，減少誤診和漏診，需要要已有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)綜合應(yīng)用，開陳出新，盡力創(chuàng)造最為適合患者診斷的實(shí)驗(yàn)手段。

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