LY294002對人乳腺癌細胞株MCF-7/ADR的耐藥逆轉作用

[摘要] 目的 探討PI3K/Akt信號轉導通路特異性阻滯劑LY294002在體外對人乳腺癌細胞株MCF-7/ADR的耐藥逆轉作用。方法 乳腺癌細胞MCF-7和MCF-7/ADR各自分為未加LY294002的對照組及加入不同濃度的LY294002組，MTT法觀察各組藥物的細胞毒作用。選用流式細胞術(FCM)檢查細胞凋亡率、細胞分布周期的變化。結果 ①LY294002在濃度10μmol/L以下時對兩種細胞基本無毒性，為安全有效的逆轉劑量。②阿霉素對MCF-7和耐藥細胞MCF-7/ADR的半數抑制濃度(IC50)分別為(0.14±0.02)μmol/L和(15.74±0.08)μmol/L，耐藥倍數為112倍。③LY294002能夠增強阿霉素對MCF-7/ADM的細胞毒作用，LY294002濃度0.1、2.5、5.0、10μmol/L分別作用于 MCF-7/ADM細胞48h后，耐藥細胞株的IC50分別降至(13.53±0.10)μmol/L、(10.24±0.08)μmol/L、(5.53±0.16)μmol/L、(2.29±0.12)μmol/L，差異有統計學意義(P<0.01)。④LY294002可顯著增加MCF-7/ADR細胞凋亡率(P<0.01)。細胞周期分布顯示，加用LY294002對各個細胞周期影響不明顯。結論 LY294002能夠增加MCF-7和MCF-7/ADR的化療敏感性，部分逆轉耐藥細胞MCF-7/ADR的多藥耐藥性。

[關鍵詞] 乳腺癌;LY294002;多藥耐藥;逆轉

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-17-03

Reverse Effect of LY294002 on Multidrug Resistance of Human Breast Cancer Cell Line MCF-7/ADR

GAO Li1ZHAO Ying2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China; 2.Department of General Surgery，the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the reverse effect of LY294002(a specific inhibitor of the signaling pathway PI3K/Akt) on the multidrug resistance of human breast cancer cell line MCF-7/ADR. Methods MCF-7 and MCF-7/ADR cells were treated with different concentrations of LY294002(LY294002 group)or without LY294002(control group). The drug cytotoxicity was detected by MTT and the apoptosis and cell cycle distribution were evaluated by flow cytometry in each group. Results ①LY294002 at a concentration of less than 10μmol/L had no obvious cell toxicity on MCF-7 and MCF-7/ADR cells，showing the concentration of LY294002 was a safe and effective reverse dose. ②The half inhibitory concentration(IC50) of ADM to MCF-7 and MCF-7/ADR cells was(0.14±0.02)μmol/L and(15.74±0.08)μmol/L， respectively， and the drug-resistant index of MCF-7/ADR was 112. ③LY294002 could enhance ADM cytotoxicity on MCF-7/ADR，and after LY294002 at the concentrations of 0.1，2.5，5.0 and 10μmol/L respectively acted on MCF-7/ADR for 48 hours，the resistant cell line IC50 was reduced to(13.53±0.10)μmol/L，(10.24±0.08)μmol/L，(5.53±0.16)μmol/L and(2.29±0.12)μmol/L， respectively(P<0.01). ④LY294002 significantly increased the apoptosis rate of MCF-7/ADR(P<0.01). LY294002 had no obvious effect on the cell growth cycle. Conclusion LY294002 is able to increase the sensitivity of MCF-7 and MCF-7/ADR to chemotherapy and partially reverse the multidrug resistance of MCF-7/ADR.

[Key words] Breast cancer;LY294002;Multidrug resistance;Reverse

乳腺癌的發病率在婦女中逐年上升，綜合治療中除手術治療外化療意義重大，長期應用化療藥可以降低乳腺癌對化療藥的敏感性，甚至出現多藥耐藥(ADR)，其主要機制可能為化療藥物誘導腫瘤細胞中的RAS癌基因表達增加，RAS蛋白激活磷脂酰肌醇-3激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidy linositol-3 kinase/serine threonine kinase PI3K/Akt)通路，活化的PI3K/AKT信號轉導通路使P-gP磷酸化活化，將進入細胞內的藥物泵出，使得細胞內藥物濃度不斷下降，最終造成細胞毒作用減弱甚至喪失，從而出現耐藥，嚴重影響了治療效果。本實驗研究LY294002(PI3K/Akt信號轉導通路特異性阻滯劑)對人乳腺癌細胞株MCF-7/ADR的耐藥逆轉作用。

1材料及主要儀器

1.1細胞株

人乳腺癌細胞株MCF-7和耐藥細胞株MCF-7/ADR購于中國醫學科學院腫瘤醫院。

1.2藥物和儀器

LY294002購于美國Cell Signaling公司，阿霉素(多柔比星)為武漢合中生化制造有限公司生產，碘化吡啶(PI)購于美國Sigma公司，細胞培養用1640培養基為美國Gibco公司，小牛血清為杭州四季青生物公司，倒置顯微鏡為日本Olympus公司，CO2培養箱為德國Binder公司，流式細胞儀為美國BD公司。

2實驗方法

2.1細胞培養

MCF-7和MCF-7/ADR細胞用含10%小牛血清的1640培養液，在37℃、5%CO2培養箱中培養。0.25%胰蛋白酶消化傳代。

2.2MTT比色法檢測

2.2.1 MTT法測定LY94002的安全濃度 實驗分MCF-7+ LY294002組、MCF-7/ADR+LY294002組、對照組，收集對數生長期細胞，調整MCF-7和MCF-7/ADR細胞濃度分別為 0.5×108cells/L和1×108cells/L，按每孔100μL鋪96孔板，培養24h，待細胞貼壁后將MCF-7和MCF-7/ADR細胞按以上分組加藥，LY294002濃度分別為5、10、20、40μmol/L，每組所加藥物最終為100μL，每組設3個復孔，培養24h后每孔加入20μL(0.5g/L)的MTT溶液，培養4h后小心吸去孔內培養液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床低速震蕩10min。自動酶標儀492nm測各孔吸光度(A)值，取三組平均值，計算細胞生長抑制率。抑制率(%)=(1-實驗組A平均值/對照組A平均值)×100%。

2.2.2MTT法測定MCF-7/ADR耐藥細胞株的耐藥倍數實驗分MCF-7+阿霉素組、MCF-7/ADR+阿霉素組、對照組。取阿霉素濃度0.1、0.2、0.4、0.8μmol/L 具體方法同上。求出阿霉素半數抑制濃度(IC50)及MCF-7/ADR細胞的耐藥倍數。耐藥倍數= MCF-7/ADR細胞 IC50/MCF-7細胞IC50。

2.2.3MTT測定LY294002對MCF-7/ADR的逆轉作用將兩種細胞各分為對照組(MCF-7+阿霉素，MCF-7/ADR +阿霉素)、實驗組(MCF-7+LY294002 +阿霉素，MCF-7/ADR +LY294002 +阿霉素)、空白組。LY294002取第一步篩選的無細胞毒性濃度范圍內取值分別為0.1、2.5、5.0、10μmol/L，每個濃度設3個復孔，余法同上。逆轉指數RF=對照組耐藥細胞IC50/實驗組耐藥細胞的IC50;相對逆轉率=(對照組耐藥細胞IC50-實驗組耐藥細胞IC50)/(對照組耐藥細胞IC50-對照組敏感細胞IC50)×100%，重復試驗3次。

2.3FCM檢測

2.3.1細胞周期和凋亡將生長狀態良好的MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞分別接種于6孔板中，24h貼壁后，按以上分組加入相應質量濃度的藥物進行培養，空白對照組加入1640培養液，48h后用0.25%胰酶將細胞消化，1000r/min離心4min，棄去上清，PBS清洗1次后，70%酒精固定4h，離心，PBS液洗2次，每次洗后1000r/min離心4min，加入質量濃度50mg/mL的PI 200μL，避光密室放置約20min，再各加入PBS液400μL，上機檢測。

2.3.2細胞內阿霉素含量的測定用75cm的細胞培養瓶培養MCF-7細胞和MCF-7/ADR細胞，消化并用培養基制成2×106 個/L細胞懸液，計數;對照組加入阿霉素，實驗組加入不同濃度LY294002與阿霉素共同作用。37℃保溫半小時，1500r/min離心2min，除去培養液，再用新培養液細胞外的阿霉素;在37℃保溫10min以后，再用1640培養液洗一次，放在冰冷的新1640培養液中待檢測;流式細胞儀以488nm的激發光測試細胞熒光強度。

2.4統計學分析

全部資料使用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，結果用均數±標準差表示，組間均數比較采用方差分析檢驗或t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。相關分析采用Pearson相關分析。

3結果

3.1MTT法檢測結果

LY294002在濃度10μmol/L以下時對兩種細胞基本無毒性，細胞存活率均>98%。乳腺癌細胞MCF-7和耐藥細胞MCF -7/ADR的IC50分別為(0.14±0.02)μmol/L和(15.74±0.08)μmol/L，耐藥指數為112，加入安全范圍的不同濃度的LY294002培養48h后，MCF-7和MCF-7/ADR細胞IC50均下降，但以MCF-7/ADR細胞下降明顯，逆轉指數明顯升高，相對逆轉率也明顯升高，具有顯著性差異(P<0.01)，逆轉作用與LY294002劑量呈正相關(P<0.01)。

3.2FCM檢測結果

3.2.1細胞凋亡取不同濃度LY294002(0.1、2.5、5.0、10μmol/L)聯合阿霉素作用于兩種細胞后，無論是MCF-7還是耐藥細胞MCF-7/ADR，細胞凋亡率均增加，但以耐藥細胞凋亡率增加更明顯，LY294002高濃度組較低濃度組增加也更明顯。組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

3.2.2細胞周期阿霉素為周期非特異性抗腫瘤藥，加藥后細胞各期阻滯不一，加用LY294002后對其細胞各周期分布的影響無統計學差異(P>0.05)。

3.2.3FCM觀察細胞內阿霉素含量的變化對于乳腺癌細胞株MCF-7，細胞內阿霉素熒光強度變化各組中無明顯差異;而對于乳腺癌耐藥細胞株MCF-7/ADR，0.1、2.5μmol/L LY294002處理組與陰性對照組相比仍無明顯差異(P>0.05)，5、10μmol/L LY294002處理組與陰性對照組相比細胞內熒光強度明顯增加，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)，可見較高濃度LY294002(5、10μmol/L)可以提高腫瘤細胞內阿霉素的濃度，使藥物在細胞內蓄積，增強細胞殺傷力。

4討論

最近腫瘤分子靶向治療研究[1-3]發現PI3K/Akt信號轉導途徑與腫瘤發生、發展、轉移和放、化療抵抗有密切的關系。多種腫瘤組織中都有AKT的過度表達和活化，PI3K/Akt通路活化可能是多藥耐藥產生的新機制，對于腫瘤耐藥逆轉治療具有十分重要的意義。盡管其參與腫瘤細胞多藥耐藥的機制得研究還不透徹，其主要機制[4，5]可能為化療藥物誘導腫瘤細胞中的RAS癌基因表達增加，RAS蛋白激活PI3K/AKT通路，活化的PI3K/AKT信號轉導通路使P-gP磷酸化活化，將進入細胞內的藥物泵出，使得細胞內藥物濃度不斷下降，最終造成細胞毒作用減弱甚至喪失，從而出現耐藥。蛋白酪氨酸激酶受體家族和TNF受體家族、IGF受體家族也可以通過相同途徑活化PI3K/Akt通路[6]，進而使細胞耐藥性產生。

Liang等[7]研究發現，作為PI3K/AKT通路的重要成員PDK1和AKT1過表達的乳腺癌細胞對化療藥物紫杉醇、阿霉素及2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷都產生不同程度的耐藥，PDK1過表達者耐藥性更強。而且在剔除了PDK1基因的MCF-7乳腺癌細胞中，2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷誘導細胞凋亡百分比較沒有剔除PDK1的MCF-7細胞中高。Clark等[8]在對乳腺癌的研究中發現，化療藥物和他莫昔芬均能顯著通過激活PI3K提高活化的Akt水平，導致細胞對化療藥物和他莫昔芬產生抗拒。并且化療藥物激活細胞蛋白酪氨酸激酶受體家族(包括EGF受體家族、PDGF受體家族、VEGF受體家族)和TNF受體家族、IGF受體家旅，活化P13K/Akt通路，使細胞產生化療抗拒。抑制IGF受體家族能夠減少PI3K/Akt通路的活化，增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，提示抑制PI3K/Akt信號轉導途徑可能會較大地提高化療藥物的治療效果。

PI3K的兩種主要的抑制劑:LY294002和wortmannin，是結構明顯不同的兩種復合物，工作濃度差異較大。LY294002的工作濃度較wortmannin大，但是其在溶液中較wortrnannin強的穩定性，因此作為PI3K的抑制劑已廣泛用于細胞生物學。LY294002有抑制生長的效應，但因其代謝快，單獨應用不能延遲細胞生長、導致細胞凋亡或死亡，較低劑量時僅有極少量的Akt去磷酸化而失活。LY294002是PI3K特異性阻滯劑，它可抑制PI3K而阻滯下游蛋白激酶B(Akt)的活性，從而阻滯了PI3K/Akt通路的信號轉導，使P-gp不能磷酸化活化，不能發揮其藥物泵作用，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[9]，逆轉腫瘤細胞耐藥。

本文結果證實，聯合應用LY294002后，阿霉素對乳腺癌細胞MCF-7和MCF-7/ADR細胞體外抑制作用明顯增強，凋亡率亦明顯增高，說明LY294002通過抑制PI3K/AKT信號轉導通路可增強乳腺癌細胞MCF-7和MCF-7/ADR的化療效果，部分逆轉MCF-7/ADR細胞耐藥，為進一步提高乳腺癌患者的生存質量和存活率提供新的契機。

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(收稿日期:2009-12-10)