腦出血患者TNF-α的表達及其臨床意義

[摘要] 目的 觀察腦出血患者TNF-α蛋白的表達情況，探討TNF-α蛋白在腦出血患者中表達特點與腦出血時間的關系和意義。方法 應用免疫組化方法檢測65例腦出血患者出血灶周圍腦組織TNF-α蛋白的表達。結果 65例腦出血灶周邊腦組織標本中，TNF-α蛋白陽性表達率為84.6%(55/65)，10例正常腦組織中TNF-α蛋白陽性表達率為0(0/10)，兩者比較有顯著性差異(P<0.01)。TNF-α蛋白在腦出血后不同時間陽性表達率分別為出血后<24h 83.0%(39/47)，出血后>24h 88.9%(16/18)，出血組之間比較無差異(P>0.05)。結論 腦出血急性期血腫周圍組織存在TNF-α高表達，且有大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞、淋巴細胞為主。TNF-α參與了腦出血腦水腫的病理生理過程，從而加重血腫周圍腦組織的損害。

[關鍵詞] TNF-α蛋白;腦出血;免疫組化

[中圖分類號] R743.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-36-02

TNF-αExpression in Intracerebral Hemorrhage and Its Clinical Significance

YANG Yanli1WEI Maofu2LIU Jingwen2

1. Third Department of Medicine， Dongguan Municipal Humen Hospital，Dongguan 523900，China;2. Department of Pathology，Dongguan Municipal Humen Hospital，Dongguan 523900，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of TNF-α in intracerebral hemorrhage(IHC) and find out its significance and its correlation with the time of intracerebral hemorrhage.Methods The TNF-αexpression was assessed by immunohistochemistry staining.Results In 65 cases of intracerebral hemorrhage，the positive expression rate of TNF-α was 84.6%(55/65) and in 10 cases of normal brain tissue， it was 0(0/10)， significantly higher in intracerebral hemorrhage than that in normal brain tissue(P<0.01). TNF-α positive expression rates were 82.98%(39/47) less than 24h after intracerebral hemorrhage and 88.9%(16/18) more than 24h after that，with no significant difference between the TNF-α expression and the time of operation after intracerebral hemorrhage(P>0.05).Conclusion The high TNF-αexpression appears in the surrounding tissue of cerebral hematoma after acute cerebral hemorrhage with a large number of inflammatory cell infiltration in it，mainly leukocyte and lymphocyte infiltration.TNF-α may be involved in the pathophysiologic process of brain edema after intracerebral hemorrhage，therefore，aggravating brain damage around hematoma.

[Key words] TNF-α;Intracerebral hemorrhage;Immunohistochemistry

腦出血(ICH)是神經(jīng)內科很常見的疾病，死亡率和致殘率較高。目前，腦出血導致腦水腫的發(fā)病機制尚未完全明了。很多學者認為導致腦水腫的原因與炎性因子密切相關，其中包括腫瘤壞死因子(TNF-α)。有研究表明TNF-α在腦損傷后表達升高，其升高程度與腦損傷嚴重程度關系密切[1]。我們采用免疫組織化學技術對65例腦出血患者和10例正常腦組織中TNF-α表達的情況進行研究，探討TNF-α在腦出血灶周的表達特點及意義。

1材料與方法

1.1標本來源

收集陜西省延安市人民醫(yī)院和延安大學附屬醫(yī)院2003年1月～2006年12月期間進行手術清除血腫的腦出血患者65例，男28例，女37例，年齡25～83歲，平均48.6歲。手術時機:發(fā)病24h內手術者47例，24h后手術者18例，正常腦組織10例取自同期住院進行顱內減壓的患者。所有的病人入院時均行頭顱影像學檢查進行證實。

1.2試劑及免疫組化染色方法

鼠抗人TNF-α單克隆抗體、抗體稀釋液及試劑盒均購自基因公司。其稀釋度為1∶50。所有標本均用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，按二步法進行免疫組化染色，染色前標本切片進行抗原修復處理，一抗在室溫孵育1h，二抗在室溫下孵育0.5h，DAB顯色，蘇木素復染。用已知陽性的對照片作TNF-α抗體的陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 判斷標準

所有免疫組化片子用奧林帕斯BX50顯微鏡進行定性和半定量評估。請三個高職稱病理醫(yī)生在不知道臨床信息的情況下獨立的對所有免疫組化片子進行評估。陽性判斷標準為細胞核或胞質出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒狀，并用陽性片作為對照。每張切片隨機選擇10個視野，40×10高倍顯微鏡下觀察計數(shù)。參照文獻[2]:根據(jù)染色強度、陽性細胞百分比分別記分:A:染色強度:不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。B:陽性細胞所占百分率:<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。根據(jù)染色強度與陽性細胞百分比得分之積分為4級，即(-)為0分，弱陽性(+)為1～2分，陽性(++)為3～4分，強陽性(+++)為5～6分。將A×B作為其染色的計數(shù)，只有A×B >3分才算免疫反應陽性，并按乘積分數(shù)將染色結果分為4個等級:-(0～2分)、+(3～5分)、+ +(6～8 分)和+ + +(9～12分)。

1.4 統(tǒng)計學方法

統(tǒng)計學處理應用SPSS10.0軟件進行χ2檢驗和Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

TNF-α主要表達于胞質中。出血灶邊緣及壞死區(qū)表達明顯增多。65例腦出血灶周腦組織TNF-α表達的陽性率為84.6%(55/65);10例正常腦組織TNF-α蛋白表達全部呈陰性(0/10)，二者比較有顯著性差異(P<0.01);TNF-α在腦出血24h內陽性表達率為83.0%(39/47)，超過24h陽性表達率為88.9%(16/18)，出血后不同時間陽性表達率比較，兩者比較無差異(P>0.05)。見表1。

3討論

很多細胞都能產(chǎn)生和分泌腫瘤壞死因子，按照其來源的不同，Shalaby在1985年將其分為TNF-α和TNF-β兩個類型，TNF-α主要由巨噬細胞激活后分泌。腫瘤壞死因子的產(chǎn)生經(jīng)過啟動以及分泌兩個階段[3]。腦出血后繼發(fā)的炎癥反應在腦缺血損傷中有重要的地位，炎癥反應在腦出血損傷中的作用受到廣泛關注。腫瘤壞死因子(TNF-α)在介導此類炎癥反應中有很重要的作用，Xue等[4]研究表明，腦出血發(fā)病后病灶中出現(xiàn)較多中性粒細胞浸潤，滲出的中性粒細胞可以釋放多種細胞因子，例如IL-6、TNF-α等，這些細胞因子加重血腫周圍神經(jīng)元細胞損傷。Mayne等[5]實驗表明，抑制腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達和中性粒細胞的浸潤，可以減少血腫內和周圍的神經(jīng)細胞凋亡。腫瘤壞死因子-α是一種多效性的促炎癥因子，在觸發(fā)炎性反應和神經(jīng)元細胞損傷中處于重要地位。本研究表明，出血急性期血腫周圍組織存在TNF-α高表達，而且有大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和淋巴細胞為主。由此我們認為TNF-α參與了腦出血腦水腫的病理生理過程，加重了血腫周圍的腦組織損害，浸潤腦組織的炎細胞產(chǎn)生的炎癥介質通過復雜的反應引起神經(jīng)元細胞的損傷，其機制可能是腫瘤壞死因子直接促進中性粒細胞向出血灶聚集，釋放更多的炎癥介質，從而加重腦出血后的腦損傷。

[參考文獻]

[1] Castillo J，Moro MA，Blanco M，et al. The release of tumor necrosis factor-alpha is associated with ischemic tolerance in human stroke[J]. Ann Neurol，2003，54(6):811-819.

[2] Liu WH，Kaur M，Wang G，et al. Inverse PCR-based RFLP scanning identifies low-level mutation signatures in colon cell and tumors[J]. Cancer Res，2004，64:2544-2551.

[3] Gong C，Hoff JT，Keep RF. Acute inflam matory reaction fo11owing experimeantal intracerebral hemorhage in rat[J]. Brain Res，2000，87(1):57.

[4] Xue M，Del Bigio MR. Intracerebral injection of autologous whole blood in rats: time course of inflammation and cell death[J]. Neurosci Lett，2000，283(3):230-232.

[5] Mayne M，F(xiàn)otheringham J，Yan HJ，et a1. Adenosine A2A receptor activation reduces proinflammatory events and decreases cell death following intracerebral hemorhage[J]. Ann Neurol，2001，49(6):727- 735.

(收稿日期:2009-12-09)