三種精子染色法的染色效果比較

[摘要] 目的 評價一種新的精子染色方法BASO(改良Diff-Quik)法在精子頂體檢測中的應用。方法 收集60例不育癥男性精液，用BASO法、改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法，同時進行染色，比較其固定和染色時間均數，并分析其精子頂體不完整率檢測的差異。結果BASO法固定和染色約需7min，明顯短于改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法，而精子頂體不完整率檢測的差異無顯著性。結論 BASO法操作步驟簡單省時，可用于臨床精子標本的染色，分析精子形態及精子頂體完整性。

[關鍵詞] 染色法;精子頂體;BASO

[中圖分類號] R446.5[文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)06-29-02

Three Kinds of Staining Methods in Evaluation of Sperm Morphology

WANG ChengZHANG HanwangLIU Qun

Center of Genesiology，Affiliated Tongji Hospital of Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

[Abstract] Objective To explore the application of a new semen staining method-BASO in the detection of perforatorium. Methods Sixty human semen samples were enrolled into this study. Three semen staining methods were used including BASO method，modified Papanicolaou method and Wright-Giemsa mixed stain. Results The fixation and staining of BASO method needed about 7min，significantly shorter than other two staining methods，and however，there was no significant difference in the detection of the incomplete rate of human perforatorium between these methods. Conclusion BASO method is simple and fast to operate，and can be used for human semen staining，semen morphology analysis and perforatorium integrity.

[Key words] Staining method;Perforatorium;BASO method

精液常規中形態染色和測定頂體酶活性是判斷精子生育力很有價值的一種方法，目前改良巴氏染色和瑞-吉氏染色被證明適合用于精子形態染色和頂體著色觀察，然而這兩種方法操作步驟繁瑣，耗時較多，不利于檢測報告的及時發放。為此，我們使用了一種新的精子染色方法BASO法，試圖通過快捷、有效的精子染色和精子頂體完整率檢測程序，為提高人工授精及體外受精環節中精液品質檢查效率提供幫助。

1材料與方法

1.1研究對象

60例不育男性均來自本院不育門診，年齡24～35歲，婚后正常性生活2年以上不育，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙史，體檢未發現有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。

1.2標本采集

禁欲3～5d后手淫留取精液在干燥消毒塑料杯內，37℃孵育箱內液化，進行檢測。

1.3BASO精子染色法

其含有A、B兩種染色緩沖液，配制無特殊要求。具體染色步驟為:涂片空氣干燥，然后用等量95%乙醇固定5min，滴1~2滴染液A液覆蓋于涂片上染15~20s，用M/15的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6～6.8)稍沖洗掉染液A液，然后稍甩干緩沖液，滴加2~3滴染液B液覆蓋于涂片上染20～30s，流水沖洗，待干燥后涂片即可直接油鏡下觀察。巴氏染色法和瑞姬氏混合染色法按照說明書步驟操作[1]。每份精子均用三種方法檢測，每種方法涂片兩張。

1.4精液常規分析

按照WHO精液分析標準進行。正常精子頭部呈橢圓形，精子頭部長度為4.0～5.0μm，寬為2.5～3.5μm。長寬之比應在1.50～1.75之間。精子長和寬的評估可借助于目鏡標尺進行[2]。尾部應是直的、均一的、比中段細、非卷曲的，其長約為45μm，計數200條精子中的正常百分率。

1.5頂體酶結果觀察

頂體的界限應清晰，占頭部的40%～70%。中段應細，寬度<1μm，大約為頭部長度的1.5倍，并且在軸線上緊帖頭部。胞漿小滴應小于正常頭部大小的一半。精子頂體不完整率=(頂體不完整的精子數/精子總數)×100%[1]。

1.6統計學處理

采用SPSS11.0軟件分析，均值比較采用多樣本均數比較的方差分析，率的比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1三種精子染色方法時間均值比較

三種精子染色方法時間均值比較具有顯著差異性(P<0.05)，BASO染色法固定時間和染色時間分別為5min和2min，明顯少于改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法。具體見表1。

2.2三種方法精子染色形態學比較

在精子及頂體形態觀察方面，BASO除精子頭稍大，其他近巴氏效果染色法。三種方法精子頂體不完整率差異無顯著性(P<0.05)，具體見表2。

3討論

精液常規檢查是男性不育癥的一項重要檢查項目，門診需要精液常規檢查的患者較多，臨床檢驗任務繁重。而精液常規檢查需要計數、精子活力檢測以及染色觀察其畸形率及頂體完整性等多項內容，而常規的改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法盡管是較為經典的精子染色手段，但是其固定染色步驟繁瑣、耗時較長，不利于檢驗報告的及時發放。因此，迫切需要簡便、省時、可靠的精子染色方法，我們使用了一種新的精子染色方法BASO法來進行精子染色，并與改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法進行了比較。

我們的研究發現BASO法染色固定和染色步驟均較常規的改良巴氏法和瑞姬氏混合染色法簡單、省時;而精子的形態與其他兩種方法比較，接近于巴氏和瑞姬氏染色后的精子形態，它較巴氏染色比較精子頭部顯示較大，更有利于非精子成分與精子成分的區分。BASO法染色后有利于精子畸形和頂體完整的觀察。已有大量研究表明精子頂體酶含量與精子頂體形態的完整有明顯的關系，精子頂體形態異常往往合并精子其他的形態異常[3]，對于臨床工作有重要的指導意義。

總之，BASO法來進行精子染色和分析頂體完整性，與傳統方法比較，步驟簡單、時間較短，但檢測結果基本一致，較為可靠，可以作為一種常規的精子染色方法在臨床上推廣應用。

[參考文獻]

[1] 黃宇烽，許瑞吉. 男科診斷學[M]. 上海:第二軍醫大學出版社，1999:84-86.

[2]曹興午，譯. 精液檢查(生殖健康最新診療技術學習班資料)[C]. 中國性學會，2008:205-209.

[3] Wang FN，Lin CT，Hong CY，et al. Modification of the Wang tube to improve in vitro semen manipulation[J]. Arch Androl，1992，29(3):267- 269.

(收稿日期:2009-11-25)