不同時期骨髓間充質干細胞移植對大鼠肝纖維化的作用

[摘要] 目的 探討骨髓間充質干細胞移植對大鼠肝纖維化的作用，并探索最佳移植時期。方法 應用貼壁培養法分離SD大鼠MSCs，分別于肝硬化造模第6周，10周經尾靜脈注射1×106MSCs。在移植4周后，評價移植組與對照組的生存狀態，行肝功能檢測(ALB，ALT，TBIL)，肝臟HE染色。結果 MSCs經尾靜脈移植入肝硬化大鼠后，大鼠肝功能均明顯改善，與對照組相比有統計學意義(P<0.05)，其中6周移植組較10周移植組效果更佳。結論 MSCs移植可以改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的組織學結構，且在肝纖維化早期進行移植效果更優。

[關鍵詞] 骨髓間充質干細胞; 移植; 肝纖維化; 大鼠

[中圖分類號] R329.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-11-02

Different Periods of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation:Effects on Rat Liver Fibrosis

ZHANG Xiaoliang1 SHANG Zhonghua2 WANG Mancang1 JIA Chenle1

1.Shanxi University，Taiyuan 030001，China;2.Department of General Surgery，the Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] ObjectiveTo investigate the effects of transplanted mesenchymal stem cells(MSCs) on the development of hepatic fibrogenesis in rats，and explore the best transplanting period. MethodsSD rat mesenchymal stem cells(MSCs) were isolated by adherent culture，and the tail vein injection of 1×106MSCs was given at the first 6 weeks and 10 weeks of Cirrhosis modeling. At 4 week after MSC transplantation，the survival state was evaluated，the liver functions(ALB.ALT.TBIL.)were detected，and the liver HE staining was carried out in the transplant group and control group. ResultsThe rat liver function improved noticeably after MSC transplantation，with a significant difference between the transplant group and control group. Conclusion MSCs transplantation can improve the biochemical characteristics of rat peripheral blood and liver histological structure，and the transplantation at the early stage of liver fibrosis may have a better result.

[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cells; Transplantation:Liver cirrhosis; Rat

肝纖維化是多數終末期肝病發展的共同階段，這一階段若得不到有效治療，最終會發展為肝硬化，甚至導致患者死亡。對于終末期肝病，原位肝移植(orthotopic livert ransplantation，OLT)理論上應是最為理想的治療選擇，但是供體的緊缺以及OLT后免疫排斥反應與高額的治療費用等又成了一個新的社會問題，即使更新的異位肝移植和原位部分肝移植也存在同樣的臨床問題[1]，因此必須尋找其他可能的解決辦法。而干細胞在一定條件下可以分化為肝樣細胞，且不存在免疫排斥，為臨床終末期肝病治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 普通級SD大鼠，5～6周齡，體重80g左右，用于MSCs的制備。成年潔凈級大鼠50只購自山西醫科大學實驗動物中心，體重200～250g，用于實驗分組，清潔級環境內喂養，自由進食。將成年清潔級大鼠隨機分為空白對照組(n=10)，肝硬化對照組(n=10)，6周移植組(n=10)，10周期移植(n=10)。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養液( Gibco公司)，低糖10%胎牛血清(杭州四季清)，胰蛋白酶(寶泰克生物技術有限公司)，PBS緩沖液(自制)，DAPI(Sigma 公司)，四氯化碳液(太原化工廠)，ALT檢測試劑盒(南京建成)，白蛋白檢測試劑盒(南京建成)，總膽汁酸檢測試劑盒(南京建成)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺BCM-1000A(國產)，CO2恒溫細胞培養箱(日本SANOY)，相差倒置光學顯微鏡(Olympus)，熒光顯微鏡(Nikon)，冰凍切片機(Leica)，DU640紫外分光光度計，低速離心機(北京醫用離心機廠)，電子天平，水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的制備 應用40%CCl4油溶液0.3mL/100g， 每周1、5皮下注射共8周，根據體重調整劑量，以不增加為準，以10%酒精為惟一飲用水，誘導肝硬化模型。

1.2.2 MSCs的分離純化體外培養[2] 取5周齡大鼠，無菌條件下分離出大鼠股骨和脛骨，剪斷兩側骨骺，暴露骨髓腔，PBS液沖洗骨髓腔，將骨髓液制成單細胞懸液，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養液培養，以1×105/mL密度接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于CO2 37℃培養箱。1天首次換液，以后每3天換液1次，8～12d細胞生長融合達80%以上，以0.125%胰蛋白酶消化，按1傳3比例傳代培養，3代后獲取較為純化的BMSCS。

1.2.3 MSC標記與移植 無菌DAPI溶液在移植當天加入培養液中使終濃度達到50μg/mL，孵育過夜，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗培養瓶6次，去除殘余的DAPI，培養細胞以0.125%胰蛋白酶消化，1500r/min離心15min，調整至每毫升培養液中含細胞數106個后用于移植。早期組于第6周經尾靜脈輸注1×106，后期組于第10周注射1×106，正常對照組及模型對照組于尾靜脈輸注等量鹽水。

1.2.4 標本的收集、保存及檢測 正常飲食飼養各組動物1個月后，1%戊巴比妥60mg/kg腹腔內麻醉，麻醉滿意后，觀察肝臟的大體改變及肝臟的重量，行肝功能檢測(ALB、ALT、TBIL)，肝臟HE染色，熒光顯微鏡檢測DAPI染色陽性細胞在肝組織的分布。

1.3 統計學方法

所有數據均采用均數±標準差表示，用SPSS17.0統計軟件包進行統計學處理。如果符合正態分布和方差齊性檢驗，則用多樣本均數兩兩之間的全面比較的LSD-t檢驗，如果不符合則秩轉換后用非參數檢驗。取α=0.05水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MSCs的分離純化體外培養

相差顯微鏡下，新分離的骨髓單個核細胞透亮度好，大小不一，懸浮于培養液中，以圓形的造血細胞居多(封三圖1)，之后造血細胞隨換液而被清除。第3天換液后，可見少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀(封三圖2)。貼壁后細胞開始分裂增殖，貼壁細胞體積增大，呈現成纖維細胞梭形外觀，有些細胞則呈三角形或多角形，核居中，有1～2個核仁(封三圖3)。傳代時幾乎呈均一的成纖維細胞樣細胞，可呈網狀、輻射狀(封三圖4)。

2.2 對移植的MSC進行觀察

DAPI是一種熒光染料，它對雙鏈DNA具有高度親和力 ，示蹤作用良好。DAPI標記的MSC的觀察熒光顯微鏡觀察(DAPI 染色×100)顯示細胞多數呈類圓形，細胞核呈明亮的藍色(封三圖5)。

2.3 血生化指標的檢測和組織病理學觀察

2.3.1 肝功血生化指標檢測 移植4周后，各組肝功能數據經Levene檢驗，方差符合齊性(P<0.05)，各組數據進行方差分析，各實驗組均較對照組有明顯改善，肝臟早期移植組較組肝功能的改善更為明顯(F=2.86，P<0.05)。見表1。

2.3.2 大鼠的一般狀況及肝臟的形態 肝硬化對照組:大鼠精神差，進食減少，體重明顯降低，剖腹后可從腹腔抽出5mL左右清亮腹水，肝臟外觀稍腫大，呈不均勻的暗紅色，表面可見大量點狀壞死。HE染色示:正常肝小葉結構消失，被假小葉所取代，肝細胞有不同程度的脂肪浸潤、片狀壞死，可見炎性細胞浸潤(封三圖6)。6周移植組:大鼠厭食、倦怠等體征消失，體重明顯增加。HE染色僅見少量炎性細胞浸潤，表明此時肝組織尚未完全恢復(封三圖7)。10周移植組:大鼠體征稍有改善，肝組織部分恢復，仍然可見損傷細胞和炎性浸潤(封三圖8)。

3 討論

干細胞定向分化為功能細胞并將其應用于器官損傷的治療，一直是人類醫學的夢想與追求的目標，骨髓干細胞移植可以使因病變減少的肝細胞數和因病變而破壞的肝組織結構得到恢復，將實現真正意義上的病肝肝細胞的再生，糾正肝細胞代謝和合成功能障礙，而且具有無來源限制、不存在免疫排斥、不易受病毒或腫瘤的污染、不存在倫理學方面的問題等優點。

Zhao等[3]研究顯示，使用二甲基亞硝胺誘導肝纖維化10d后進行BMSC移植的效果較20d后進行者為好。另有學者發現，四氯化碳誘導肝纖維化1周后再行BMSC移植，雖可見肝內種植，但并無抗纖維化作用，由此認為，BMSC移植應在肝纖維化早期進行[4]。然而，更多的研究表明在肝纖維化模型第4～6周進行BMSC移植仍具有較好的抗纖維化效果，但對已經硬化的肝臟效果不理想[5]。ShuiiTerai等也證實骨髓細胞在慢性肝硬化中更易于植入并轉化為肝細胞。然而，我國有學者采用BMSC經肝動脈移植治療30例失代償期肝硬化患者取得了滿意效果，肝功能和臨床癥狀均明顯改善，未見嚴重不良反應和并發癥的發生，表明干細胞移植對嚴重肝纖維化和肝硬化也有治療作用。

本實驗表明移植4周后，移植組肝功能(如血清白蛋白水平升高、谷丙轉氨酶、總膽紅素水平降低等)得到改善，生活質量(如食欲好轉、體重增加、腹水減少等)得到提高，且6周移植組較10周移植組效果更佳，所以我們認為MSCs移植應在肝纖維化早期進行，推測其可能在肝纖維化早期大鼠體內更能有效地分化成為具有肝細胞功能的細胞，進而改善外周血液的血生化特性和肝的組織學結構，但具體機制仍值得我們進一步研究。

[參考文獻]

[1] Starzl TE，Demetris AJ. Liver transplantation:a 31-year perspective[J].Curr Probl Surg，1990，27(3):202-222.

[2] 郭立迭，王捷，夏冰. 改良法培養骨髓基質干細胞向成骨細胞分化的實驗研究[J]. 實用醫學雜志，2006，22(2):131.

[3] Zhao DC，Lei J X，Chen R，et al. Bone marrow-derived mesen-chymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats[J]. World J Gast roenterol，2005，11(1):3431-3440.

[4] Fang B，Shi M，Liao L，et al. Systemic infusion of FLK1(+)mesenchymal stem cells ameliorate carbon tet rachloride-induced liver fibrosis in mice[J]. Transplantantation，2004，78(2):83-88.

[5] Ishikawa T，Terai S，Urata Y，et al. Fibroblast growth factor 2 facilitates the differentiation of transplanted bone marrow cells into hepatocytes[J]. Cell Tissue Res，2006，323(5):221-231.

(收稿日期:2009-12-04)