大鼠胰島細胞和骨髓間充質干細胞聯合移植治療糖尿病小鼠的研究

[摘要] 目的 觀察骨髓間充質干細胞誘導異種胰島細胞移植的免疫耐受作用。方法 4周齡SD大鼠作為供體，密度梯度離心法分離間充質干細胞，膠原酶消化法分離胰島細胞，鏈脲佐菌素制備糖尿病模型BALB/C小鼠25只。將成模小鼠分為:A組(胰島細胞聯合骨髓間充質干細胞移植組)10只，B組(單純胰島細胞移植組)10只，均經門靜脈注射途徑注入肝臟，C組(對照組)5只，僅經門靜脈注入等量生理鹽水，比較各組血糖改善情況。結果 兩實驗組均較對照組有顯著差異，其中胰島細胞聯合間充質干細胞移植組效果優于單純胰島細胞移植組。結論 骨髓間充質干細胞可以誘導小鼠對大鼠胰島細胞的免疫耐受，延長胰島細胞移植物的存活時間。

[關鍵詞] 胰島細胞移植; 間充質干細胞; 糖尿病

[中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)03-05-03

Combination Transplantation of Rat Islet Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Diabetic Mouse

JIA Chenle1 SHANG Zhonghua2 ZHANG Xiaoliang1 WANG Mancang1

1.Department of General Surgery，the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] ObjectiveTo observe the immune tolerance of bone marrow mesenchymal stem cells induced xenogenic islet cell transplantation. MethodsWe used 4-week-old SD rats as donors，the centrifugation of mesenchymal stem cells was performed by using density gradient，the separation of islet cells by collagenase digestion，and the preparation of of 25 STZ-diabetic model BALB/C mice with Streptozotocin. The model mice were divided into three groups:group A(combination transplantation of rat islet cells and bone marrow mesenchymal stem cells in10 mice)，group B(islet cell transplantation by the portal vein injection into the liver channel in 10 mice)and Group C(control group，normal saline by portal vein injection in 5 mice. The blood glucose improvement in each group was compared. ResultsGroups A and B showed a significant difference compared with Group C，with the effect of Group A superior to that of Group B. ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells can induce the immune tolerance of the mice to the rat islet cells and extend the survival time of islet cell graft.

[Key words]Islet cell transplantation; Mesenchymal stem cells; Diabetes

胰島B細胞替代治療是糖尿病治療的理想狀態。目前，胰腺移植供體缺乏，操作復雜，費用昂貴，難以廣泛開展;胰島細胞移植并發癥少，技術簡單，經濟安全，易推廣，但就完全脫離胰島素而言，效果尚不如意，而且需要多個供體為一個受體提供細胞，供體的缺乏更加突出。目前，移植排斥反應仍然是胰島移植無法逾越的障礙，絕大多數胰島細胞在移植后的數小時內就被破壞殆盡，一年不依賴胰島素率僅為8%。2000年，加拿大Shapiro等采用Edmonton方案取得連續7例胰島移植的成功，患者不依賴胰島素治療時間長達17個月，被認為是胰島移植發展史上的里程碑。2006年，Shapiro等總結了嚴格以Edmonton方案為基礎的臨床胰島移植，結果發現，僅有58%的患者取得胰島移植成功，然而，長期隨訪觀察卻發現2年胰島素不依賴率降至31%[1，2]。BMSCs不表達MHCII類分子，不表達或低表達MHCI類分子，異種移植也不會產生免疫排斥反應，而且具有很強的免疫抑制作用。本實驗以BMSCs聯合胰島細胞移植，評價BMSCs對移植胰島細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑準備

動物:6～8周齡SPF級BALB/C小鼠30只，4周齡SPF級SD大鼠20只，河北醫科大學實驗動物中心提供。試劑:L-DMEM培養基(Gibco公司)、紅細胞裂解液、鏈脲佐菌素、Ficoll(Sigma公司)、膠原酶V(美國Roche公司)、全自動血糖儀(天津九安)，PBS液(自制)。儀器:超凈工作臺BCM-1000A(國產)，CO2恒溫細胞培養箱(日本SANOY)，低速離心機(北京醫用離心機廠)，相差倒置光學顯微鏡(Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離 擴增4周齡SD雄性大鼠，無菌條件下取出其股骨和脛骨，以L-DMEM沖出骨髓，制成單細胞懸液，緩慢加入到密度為1.077g/mL的percoll液中，體積比為1∶1，400g離心10min，離心后液體由上至下依次為:稀釋液層、富含有核細胞的白膜層、分離液層及管底的紅細胞層，吸取中間的白膜層，再用PBS液沖洗兩次，接種于含L-DMEM完全培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度孵箱培養，次日與胰島細胞混合移植。

1.2.2 大鼠胰島細胞的分離和培養 SD大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，消毒腹部，取正中切口，結扎胰管注入十二指腸末端處，向膽總管內注入膠原酶V濃度0.5mg/mL的Hanks液10mL，使胰腺充分膨脹，迅速摘取胰腺，置于37℃水浴中震蕩5min，取出后用眼科剪剪成1mm3的碎塊，加上述Hanks液2mL，移入小離心管后，37℃震蕩消化5min，再用20mL 4℃的Hanks液終止消化，用Hanks液沖洗離心，去上清液，重復消化二次，消化物通過60目篩網過濾，收集濾液于10mL離心管中，靜置后5min后，180g室溫離心5min，棄上清，再洗滌2次。收集細胞，移入RPMI-1640完全培養液，次日移植。

1.2.3 小鼠糖尿病模型的建立和胰島移植 BALB/C小鼠禁食過夜后腹腔注射2%鏈脲佐菌素180mg/kg，連續2次血糖測定超過16.15mmol/L并穩定2～3d提示造模成功。造模成功后，10%水合氯醛麻醉小鼠，取腹部正中切口，將SD供體大鼠的BMSCs和胰島細胞懸液經門靜脈移植入A組小鼠，B組小鼠僅注射胰島細胞，C組小鼠注射生理鹽水，每只大鼠收獲的細胞對應一只小鼠。移植完畢后，全層縫合切口，應用抗生素預防感染。

1.2.4 移植效果的檢測 分別在移植后1d，5d，15d后，由小鼠尾切口取血，用全自動血糖儀測定血糖。

1.3 統計學方法

所有數據均采用(均數±標準差)表示，用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學處理。應用方差分析SNK法，檢驗水準α=0.05，P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs的形態

經密度梯度離心的BMSCs形態比較均一，剛接種時呈懸浮生長，第二天大部已經貼壁，呈梭形，紡錘形，巢狀生長，如封三圖1所見。

2.2 胰島細胞的形態

經膠原酶消化后的大鼠胰腺組織的懸液在倒置顯微鏡下觀察，見有大小不一，圓形或卵圓形的淡黃色細胞團和散在細胞，用雙硫腙染色后染成紅色或猩紅色的細胞團為典型胰島，胰島直徑大小不一，胰島內胰島細胞數量不等，外分泌組織不著色，如封三圖2所見。

2.3 移植后血糖水平觀察(表1)

各組數據經Levene檢驗，方差符合齊性(P<0.05);不同組血糖控制水平的比較，三組間進行方差分析，F=7.97，P<0.05，認為有統計學意義，A組與B組對比，即聯合移植組與單獨胰島細胞移植組比較，有統計學意義(P<0.05)，聯合移植比單純胰島細胞移植更好的控制血糖水平正常，說明BMSCs和胰島細胞聯合后，MBSCs對胰島細胞起到了保護作用，延長了胰島細胞移植物的存活時間。

3 討論

間充質干細胞來源于胚胎時期的中胚層，存在于骨髓、血液、胎盤、臍帶和脂肪組織中，有很強的分化能力，不但可以分化為中胚層的各種組織成分，還可以分化為內胚層和外胚層的各種組織，生長能力旺盛，不易衰老，低溫保存后活性仍不減低，不表達MHCII類分子，不表達或低表達MHCI類分子，異基因移植甚至異種移植時也不會發生明顯的免疫排斥反應，而且表現出一定的免疫抑制效應[3]。MSCs抑制T細胞有絲分裂和克隆增殖，而且這一作用不存在種屬依賴性，第三物種的MSCs也表現出明顯的免疫抑制作用[4]。在體外，MSCs具有抑制T細胞增殖的活性[5，6]，可直接抑制異體移植物和促有絲分裂T淋巴細胞增殖，影響原始和記憶響應。動物實驗也表明MSCs有免疫特赦性，可在同種異體間或者異種間進行移植，而且很少發現免疫排斥反應[7]。這些實驗均表明了，MSCs具有異基因移植物免疫和耐受調節作用。Krampera等[8]報道CD4+、CD8+T細胞均可以抗原依賴方式與人MSC結合，傳遞信號給CD4+淋巴細胞以促進其增殖和細胞因子的分泌。然而與T細胞的直接接觸是否為MSC免疫抑制作用的必要條件目前尚不十分清楚。

Itakura等[9]同時把供體的胰島和MSC植入大鼠的門靜脈，觀察到移植物存活延長的同時移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發生也降低。本文中采用供體SD大鼠BMSCs和胰島細胞懸液經門靜脈植入受供小鼠，以及單獨胰島細胞植入，結果顯示相對單純胰島細胞移植組，聯合移植組小鼠血糖顯著降低，且可長時間控制血糖水平維持在正常水平，與對照組與單獨胰島細胞移植組對比有統計學意義(P<0.05)。MSC對胰島細胞免疫耐受的誘導機制有待進一步研究，MSC容易體外擴增，來源豐富，易保存，為器官移植中特異性免疫耐受開辟了新途徑。

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[9] Itakura S，Asari S，Rawson J，et al. Mesenchymal stem cells facilitate the induction of mixed hematopoieticchimerismandislet allograft tolerance without GVHD in the rat[J]. Am J Transplant，2007，7(2):336.

(收稿日期:2009-10-23)