灰黃霉素磷脂復合物的制備及釋放率研究

張偉光 趙 楠 侯 然 黃月蓉 龐成業 李欣博

(齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

灰黃霉素是從灰黃青霉培養液中提取出的一種含氯代謝產物, 為白色或類白色結晶性粉末,無臭,稍有苦味,能溶于無水乙醇、二甲基甲酰胺和丙酮等溶劑,在水中溶解度很小[1]。灰黃霉素屬于非多烯類抗真菌抗生素，主要用于治療頭癬、皮膚癬、及手足癬等體表真菌感染，對頭癬療效特別顯著[2]。其經皮膚吸收后主要沉積在上皮的角質層，與角蛋白結合，并滲透入毛囊，從而消除真菌感染[3]。灰黃霉素對小芽孢菌、紅色癬菌有很好的抑制作用，在農業生產中可以用于防治真菌病害，如一種在蘋果授粉時引發感染的念珠菌病[4]。灰黃霉素乳劑含有兩性表面活性劑、助乳化劑及助溶劑，具有一定的載藥能力，能夠使藥物處于溶解狀態，并具有增加吸收面積、減少代謝等特點[5]。本文將灰黃霉素制成磷脂復合物，從而提高其脂溶性，延長藥物的吸收與作用時間，增加生物利用度[6，7]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通儀器有限公司)；微濾膜(0.35 μm截留分子量14 000，大連依利特分析儀器公司)；800型臺式離心機(上海浦東物理光學儀器廠); RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；SK2200HP超聲清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；SHZ-IIIB循環水真空泵(浙江臨海市精工真空設備廠)。

灰黃霉素標準品(上海晶抗生物工程有限公司)；粉狀高純大豆磷脂，自制；灰黃霉素(上海醫藥集團有限公司信誼制藥總廠)；無水乙醇，四氫呋喃，二氯甲烷等均為分析純。

1.2 磷脂復合物的制備

根據文獻[8-10]，稱取一定量的大豆粉狀高純磷脂和20 mg灰黃霉素置于150 mL梨形瓶中，加入一定量四氫呋喃-二氯甲烷混合溶劑, 充分混合均勻，并置于超聲條件下進行復合反應。超聲復合完成后，減壓蒸餾除去溶劑，即得灰黃霉素-磷脂復合物。

1.3 灰黃霉素磷脂復合物含量測定

1.3.1 檢測波長的確定

配制灰黃霉素標準品的無水乙醇溶液，190～900 nm 范圍內進行紫外掃描，其最大吸收波長為290.50 nm,所以確定檢測波長為291 nm。

1.3.2 標準曲線

以無水乙醇為溶劑，精密配制灰黃霉素濃度分別為5.0、25.0、50.0、80.0、100.0、120.0 μg/mL的一系列標準溶液。在291 nm處測量以上溶液的吸光度，以吸光度(A)對濃度(C)進行線性回歸,得回歸方程：A=0.078 2C+0.013 7，r=0.999 6。表明，灰黃霉素在5.0～120.0 μg/mL內濃度與吸光度呈良好線性關系。

1.3.3 精密度實驗

精密吸取濃度為25.0、50.0 μg/mL標準溶液各20 μL，重復進樣6次，分別測定吸光度， RSD分別為0.46%和0.65%(n=6)。

1.3.4 回收率實驗

取灰黃霉素標準品0.002 7、0.005 2、0.006 3 g,分別置于是100 mL容量瓶中，加入20 mL無水乙醇溶解，然后加入50 μg/mL的標準溶液25 mL，再加無水乙醇稀釋至刻度。搖勻后進樣，測定灰黃霉素的含量。計算得，平均回收率為97.28%，RSD=0.87%(n=3)。

1.4 磷脂復合物復合率的測定

稱取已制備好的適量樣品置于燒杯中，加入適量正己烷溶解，再經微孔濾膜過濾，收集濾液，減壓蒸發去除正己烷，固體用無水乙醇溶解并稀釋，于291 nm測定灰黃霉素的吸光度，利用標準曲線回歸方程，計算復合物中灰黃霉素的含量。根據初始投料量(M0)與復合物中灰黃霉素的質量(Mt)計算復合率：復合率(%)=Mt/M0×100%。

2 結果與討論

2.1 正交設計確定磷脂復合物最佳制備條件

2.1.1 正交試驗

根據制備灰黃霉素磷脂復合物的初步實驗分析, 可知影響磷脂復合物復合率主要因素有:m(磷脂)∶m(灰黃霉素)、V(四氫呋喃)∶V(二氯甲烷)、固液比、超聲溫度以及超聲時間。用L16(45)進行正交試驗，確定配方比例見表1。

表1 L16 (45)正交實驗的因素和水平

按照表2正交實驗設計確定的配方進行實驗，以復合率為指標，結果見表2。

從表2中可看出，灰黃霉素磷脂復合物的最佳工藝條件為的實驗驗號為A3B3C3D3E4，即m(磷脂)∶m(灰黃霉素)=3∶1、V(四氫呋喃)∶V(二氯甲烷)= 1.5∶1、固液比=8∶1、超聲溫度50 ℃、超聲時間150 min。對復合率的影響因素貢獻依次為: D>E>A>C>B，即超聲溫度>超聲時間>m(磷脂)∶m(灰黃霉素)>固液比>V(四氫呋喃)∶V(二氯甲烷)。

表2 L16 (45)正交實驗結果和分析

2.1.2 驗證試驗

以A3B3C3D3E4進行三次平行試驗，其復合率分別為91.89%，92.06%，91.95%，平均復合率為91.97%，結果與正交實驗基本相符。

2.2 體外釋放研究

根據文獻[11]分別將含有15 mg灰黃霉素的溶液與15 mg灰黃霉素磷脂復合物的懸浮液放入透析袋中，浸入裝有150 mL pH7.4磷酸鹽緩沖液的錐形瓶中,并以120 r/min的速率攪拌。分別在不同時間取出5 mL溶液并測定灰黃霉素的質量濃度。灰黃霉素的釋放率=m1/m0，其中m0是灰黃霉素的初始量，而m1是其釋放量。

如圖1所示，在初始階段，灰黃霉素和磷脂復合物的釋放速度非常快，最初的3h內接近100%的灰黃霉素及63.73%的復合物釋放到了溶液中，在3～11 h階段，磷脂復合物表現出持續釋放行為。

圖1 灰黃霉素及磷脂復合物的釋放率

3 結論

本文采用溶劑揮發法制備了灰黃霉素磷脂復合物，采用紫外分光光度法測定了其復合率,并通過正交試驗確定了最佳制備條件為：m(磷脂)∶m(灰黃霉素)=3∶1、V(四氫呋喃)∶V(二氯甲烷)=1.5∶1、固液比=8∶1、超聲溫度50 ℃、超聲時間150 min。在此條件下，灰黃霉素磷脂復合物的復合率為91.97%。體外釋放研究表明，磷脂復合物使灰黃霉素的脂溶性有較大提高，改變了灰黃霉素體外快速釋放的特性。