L-精氨酸誘導實驗性慢性胰腺炎大鼠模型的可行性分析

滿曉華 趙航 徐克群 龔燕芳 高軍 杜奕奇 許愛芳 李兆申

L-精氨酸誘導實驗性慢性胰腺炎大鼠模型的可行性分析

滿曉華 趙航 徐克群 龔燕芳 高軍 杜奕奇 許愛芳 李兆申

目的初步探討L-精氨酸誘導慢性胰腺炎大鼠動物模型的可行性。方法將實驗動物按完全隨機法分為對照組及精氨酸12、24 h和7 d組，每組10只，間隔1 h分兩次腹腔內注射L-精氨酸溶液造模。造模后相應時間點檢測血淀粉酶、血糖水平，對胰腺組織進行病理評分，Van Gieson法對胰腺膠原纖維染色。結果對照組及精氨酸12、24 h和7 d組的血淀粉酶水平分別為(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L 和(1 561±304)U/L，精氨酸7 d組血淀粉酶水平顯著低于12 h和24 h組(Plt;0.05)，恢復到對照組水平。各組間血糖水平無明顯差異。對照組及精氨酸12、24 h和7 d組胰腺的病理分值分別為0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d組胰腺病理評分顯著低于24 h組(Plt;0.05)，但仍顯著高于對照組(Plt;0.05)。精氨酸7 d組膠原染色范圍明顯增加，其他各組未見明顯膠原染色。結論L-精氨酸腹腔注射后7 d可引起胰腺組織纖維化及管狀復合結構增生，可用于探索慢性胰腺炎大鼠模型。

胰腺炎，慢性； 精氨酸； 模型，動物； 大鼠

L-精氨酸腹腔注射可以成功誘導急性胰腺炎動物模型，以往沒有研究嘗試應用精氨酸誘導慢性胰腺炎(chronic pancreatitic, CP)。我們前期實驗發現，精氨酸注射后7 d，大鼠胰腺組織顯著萎縮，被肉芽組織增生取代，同時伴有導管增生和漿細胞浸潤。本項研究就精氨酸誘導CP大鼠模型的可行性進行分析。

材料和方法

一、實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dwley(SD)大鼠，體重250～300 g，SPF級，由第二軍醫大學實驗動物中心提供。在室溫20～28℃、相對濕度40%～70%的動物房內適應性喂養1周后開始實驗，實驗前12 h起禁食，不控制飲水。

按完全隨機法將大鼠分為對照組及胰腺炎12、24 h和7 d組，每組10只。將L-精氨酸粉劑溶于生理鹽水配制成20%溶液，調節pH值至7.6～7.8。在劍突下3 cm中線位置進針，注射20% L-精氨酸溶液1 ml/100 g體重，間隔1 h后，重復注射1次。注射后大鼠禁食，可自由飲水，觀察大鼠一般情況。在相應時間點處死各組大鼠，獲取血液、胰腺、肺臟標本。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

二、血淀粉酶、血糖檢測

采用HITACHI-7150型自動生化分析儀測定。

三、胰腺組織病理檢查及膠原染色

取胰頭部胰腺組織2～3塊，常規標本固定、石蠟包埋、切片、HE染色，按照Schmidt等[1]標準從胰腺水腫、壞死、出血和炎細胞浸潤4個方面進行評分。同時，應用Van Gieson法進行膠原纖維染色。

四、統計學處理

實驗數據應用統計軟件SPSS13.0進行分析，計量資料采用t檢驗及方差分析，并進行正態分布驗證，樣本率比較采用χ2檢驗，取α=0.05為臨界值。

結 果

一、血淀粉酶、血糖的變化

對照組及精氨酸12、24 h和7 d組的血淀粉酶水平分別為(1 634±890)U/L、(3 872±2 676)U/L、(3 307±2 197 )U/L和(1 561±304)U/L。精氨酸7 d組的血淀粉酶水平顯著低于精氨酸12 h和24 h組(Plt;0.05)，恢復到對照組水平。對照組及精氨酸12、24 h和7 d組血糖水平分別為(6.5±1.7)mmol/L、(5.2±1.5)mmol/L、(5.0±1.1)mmol/L和(6.3±2.2)mmol/L，各組間無明顯差異(Pgt;0.05)。

二、胰腺病理改變

對照組胰腺大體呈粉紅色，組織柔軟，胰膽管清晰可見。光鏡下見胰腺組織結構清晰，腺泡小葉完整，間質無滲出；精氨酸12、24 h組大鼠可有少到中量腹水，腹水混濁，呈灰黃色或暗紅色。胰腺大體可見明顯充血、水腫、出血，部分大鼠可見黃白色鈣皂斑。光鏡下見12 h組胰腺間質內大量炎細胞浸潤，散在分布的壞死胰腺腺泡細胞及出血，腺泡實質內見紅細胞及中性粒細胞浸潤。24 h組胰腺組織損傷更加嚴重，腺泡結構明顯破壞，大片壞死組織，大量炎細胞浸潤，間質脂肪組織內可見出血、壞死；精氨酸7 d組胰腺組織體積明顯減小，光鏡下見肉芽組織增生，充血，水腫，急、慢性漿細胞浸潤，小導管增生，腺泡數量明顯減少(圖1)。對照組、精氨酸12、24 h和7 d組胰腺的病理分值分別為0.8±0.4、5.1±2.6、6.5±2.2和4.5±1.6，精氨酸7 d組胰腺病理評分顯著低于精氨酸24 h組(Plt;0.05)，但仍顯著高于對照組(Plt;0.05)。

三、胰腺膠原染色

對照組幾乎無膠原染色。精氨酸12、24 h組胰腺有少許膠原染色，主要位于小血管分布區域，小葉間隙及實質中無膠原染色。精氨酸7 d組膠原染色范圍明顯增加，包括增生的小導管區域，在小葉間隔及胰腺實質內也可以見到明顯的網狀紅色膠原染色(圖1)。

討 論

圖1對照組(A)、精氨酸12 h組(B)、精氨酸7 d組(C)胰腺病理(上)及膠原染色圖(下) (HE、Van Gieson染色 ×100)

簡便易行且重復性好的CP動物模型是進行CP相關動物實驗研究的必要條件，也是眾多研究者努力尋求的目標。迄今為止，已經采用的造模方法包括三硝基苯磺酸胰管內注射法、膽總管遠端結扎法、油酸胰管內注射法、二氯二丁基靜脈注射法、雨蛙素注射法、乙醇灌注法等[2-4]。這些造模方法模擬人類CP發病因素某個或多個環節，能夠制作出類似CP病理表現的動物模型，部分造模方法被認為其誘導CP發病，符合CP發病過程，可以用于探討CP發病機制和相關病理生理變化。然而，上述方法普遍造模周期較長，部分方法操作相對困難，穩定性不佳。精氨酸法通常用于急性胰腺炎模型制作，我們在實驗中發現，應用精氨酸法制作急性胰腺炎模型的大鼠，在造模后第7天，胰腺腺泡組織高度萎縮，伴有小導管增生，管狀復合結構形成，符合CP組織損傷病理特點，因而試圖探索精氨酸制作CP模型的可行性。本研究結果顯示，精氨酸注射后7 d，胰腺原有腺胞組織嚴重破壞，被肉芽組織增生取代，充血，水腫，急慢性漿細胞浸潤，小導管增生，腺泡明顯減少，并且血淀粉酶水平顯著低于精氨酸12、24 h組，膠原含量較精氨酸12、24 h組顯著增多。

胰腺組織纖維化是CP的主要病理特征之一，是由于細胞外基質合成和降解失衡引起。L-精氨酸導致急性胰腺炎的機制目前尚未闡明，有人推測氨基酸失衡參與其發生，另外有研究證實L-精氨酸誘導急性胰腺炎過程中，有細胞骨架結構改變，氧自由基、NO和炎性介質參與其中，并且存在內質網應激[5]。各個因素發生先后順序及何為始動因素尚不知曉，在其共同作用下，胰腺腺泡細胞在較短時間內大量破壞，同時伴有大量炎細胞浸潤。本實驗證實，在隨后1周時間內，胰腺小導管增生，胰腺實質內發生纖維化改變，血淀粉酶含量降低，在一定程度上符合CP病理改變。精氨酸7 d組的病理切片上顯示胰島組織數量減少，但其血淀粉酶和血糖水平與對照組均無明顯差異，與人類CP臨床表現仍有少許差異。我們設想，適當延長精氨酸造模時間，或添加輔助誘導劑可能進一步完善該模型方法。

[1] Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy.Ann Surg,1992,215:44-56.

[2] 王興鵬,龔自華,吳愷,等.三硝基苯磺酸誘導大鼠慢性胰腺炎模型的建立.中華病理學雜志,2003,32:267-269.

[3] 寇毅，李延青，孟敏，等.膽源性慢性胰腺炎動物模型建立初步研究.中華消化雜志,2006,26:31-34.

[4] 何新紅，陸建平，廖專，等.二丁基二氯化物尾靜脈注射建立大鼠慢性胰腺炎模型.胰腺病學,2007,7:17-20.

[5] Dawra R,Sharif R,Phillips P,et al.Development of a new mouse model of acute pancreatitis induced by administration of L-arginine.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2007,292:G1009-1018.

2008-06-30)

(本文編輯：屠振興)

FeasibilitystudyofinductionofexperimentalchronicpancreatitiswithL-arginine

MANXiao-hua,ZHAOHang,XUKe-qun,GONGYan-fang,GAOJun,DUYi-qi,XUAi-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the feasibility of induction of experimental chronic pancreatitis rat model with L-arginine.MethodsAnimals were randomly divided into control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group with 10 rats in each group. L-arginine solution was intraperitoneally injected twice with an interval of 1 h. Serum amylase and glucose levels at corresponding time points were detected and histopathological scores of pancreas were evaluated. Collagen in pancreas was stained with Van Gieson method.ResultsSerum amylase levels were (1 634±890)U/L, (3 872±2 676)U/L, (3 307±2 197)U/L and (1 561±304)U/L in control group, arginine 12 h group, arginine 24 h group and arginine 7 d group, respectively. The serum amylase level in arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 12 h group and arginine 24 h group (Plt;0.05). There was no significant difference in serum glucose level among all the groups. Histopathological scores were 0.8±0.4, 5.1±2.6, 6.5±2.2 and 4.5±1.6, respectively. The histopathological score of arginine 7 d group was significantly lower than those in arginine 24 h group (Plt;0.05). Obvious collagen could be found in pancreatic parenchyma in arginine 7 d group, while little collagen was found in pancreatic tissue in control, arginine 12 h and arginine 24 h groups.ConclusionsInjection of L-arginine induced fibrosis in pancreatic parenchyma and proliferation of tubular complex 7 days later, and it could be used for chronic pancreatitis model induction.

Pancreatitis, chronic; Arginine; Animal, model; Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.011

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院消化內科(趙航現在上海交通大學附屬第一人民醫院消化內科)

共同第一作者：趙航

李兆申，Email: zhsli@81890.net