p38絲裂原活化蛋白激酶對急性壞死性胰腺炎大鼠低鈣血癥的影響

方勇木 黃鶴光 周一農

p38絲裂原活化蛋白激酶對急性壞死性胰腺炎大鼠低鈣血癥的影響

方勇木 黃鶴光 周一農

目的探討p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉導通路對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠低鈣血癥和甲狀旁腺激素受體1(PTHR1)表達的影響。方法將雄性SD大鼠72只按完全隨機法分為ANP組、SB203580干預(SB)組和假手術(SO)組，每組分3 、6、12 h 3個時間點，每個時間點8只。以5%牛磺脫氧膽酸鈉逆行胰膽管注射建立ANP 模型，SB組在造模前30 min腹腔注射p38MAPK特異抑制劑SB203580 10 mg/kg體重。觀察各組血清鈣濃度，蛋白質印跡法(Western blotting)分析骨組織磷酸化p38MAPK(P-p38 MAPK)和TNF-α變化，實時RT-PCR檢測骨組織PTHR1 mRNA表達。結果制模后6 h，SO組、ANP組和SB組血清鈣濃度分別為(2.50±0.08)mmol/L、(2.11±0.06)mmol/L和(2.35±0.10)mmol/L；骨組織P-p38 MAPK表達量分別為0.14±0.04、0.80±0.06和0.33±0.05；骨組織TNF-α表達量分別為0、0.91±0.04和0.44±0.03；骨組織PTHR1 mRNA表達量分別為1.00±0.12、0.23±0.04和0.44±0.06。SB組骨組織P-p38 MAPK及TNF-α表達較ANP組顯著降低(Plt;0.01)；骨組織PTHR1 mRNA表達量及血清鈣濃度較ANP組顯著增加(Plt;0.01)。結論p38MAPK信號轉導通路可介導ANP低鈣血癥的發生，抑制該通路可改善ANP低鈣血癥。

胰腺炎，急性壞死性； p38絲裂原活化蛋白激酶類； 低鈣血癥； 受體，甲狀旁腺激素； 腫瘤壞死因子

重癥急性胰腺炎(SAP)低鈣血癥的發病機制復雜，至今尚未完全闡明。我們前期研究證實，細胞因子與SAP低鈣血癥發生有關[1]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉導通路在機體應激和炎癥反應調控過程起著極其重要的作用。本實驗應用p38MAPK特異的抑制劑SB203580干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，探討p38MAPK信號轉導通路對ANP大鼠低鈣血癥和甲狀旁腺激素受體1(parathyrin receptor 1,PTHR 1)表達的影響。

材料和方法

一、實驗動物分組

健康成年雄性SD大鼠72只，體重250～270 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(SCXK滬2007-0005，NO：0036178)。應用完全隨機法分為ANP組、SB組和假手術(SO)組，每組又分造模后3、6、12 h 3個時間點，每個時間點8只大鼠。參照楊波等[2]方法，采用逆行膽胰管注射5%牛磺脫氧膽酸鈉1.0 ml/kg體重制備ANP模型。SB組在造模前30 min腹腔注射p38MAPK特異的抑制劑SB203580(美國InvivoGen公司)10 mg/kg體重[3]。SO組在開腹后，僅輕輕翻動十二指腸及胰腺后關腹。

各組大鼠在相應時間點分別再次麻醉后開腹，下腔靜脈采血2 ml。迅速切取大鼠后肢股骨下端、脛骨上端，放入液氮速凍后置-80℃冰箱凍存。

二、檢測指標和方法

1．血清鈣濃度測定：采用全自動生化分析儀檢測。

2．骨組織磷酸化p38MAPK(P-p38MAPK)和TNF-α表達檢測： 應用蛋白提取試劑盒(Pierce公司)提取骨組織總蛋白，常規行Western blotting。抗P-p38MAPK一抗(Santa Cruz Biotechnology公司)1∶300，稀釋，抗TNF-α及β-actin一抗(博士德公司)1∶400稀釋，最后加入ECL試劑，壓片顯影。圖像采用Bandscan軟件分析，以目的條帶與β-actin的比值表示各組蛋白質表達水平。

3．骨組織PTHR1mRNA檢測：采用實時定量RT-PCR法。用Trizol試劑盒(TaKaRa公司)提取骨組織總RNA，并用DNase I去除其中的DNA雜質。PTHR1引物：上游5′-CCAGTGCTCAGCTCCGCATA-3′,下游5′- TCCTTGAGCAGCTTGTCACATTG -3′，片斷長度113 bp；β-actin(內參)引物：上游5′- CCCATCTATGAGGGTTACGC -3′,下游5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC -3′，片斷長度150 bp。進行逆轉錄反應后，使用SYBR Green I Real Time RT-PCR試劑盒，在Light Cycler Real Time PCR儀(Roche Diagnostics公司)上采用兩步法PCR 擴增標準程序進行基因擴增。反應結束進行產物特異性驗證(圖1)，根據2-△△Ct法[4]，以對照組△Ct平均值作為校正數，△△Ct=(Ct 目的基因-Ct 內參基因)實驗組-(Ct 目的基因-Ct 內參基因)對照組,算出目的基因的相對表達量。

三、統計學方法

結 果

一、血清鈣濃度變化

ANP組各時間點血清鈣濃度較SO組均明顯降低(Plt;0.01)；SB組各時間點血清鈣濃度又較ANP組明顯回升(Plt;0.05或Plt;0.01，表1)。

二、骨組織P-p38MAPK和TNF-α的變化

SO組各時間點骨組織P-p38MAPK弱表達，TNF-α幾乎不表達；與SO組比較，ANP組各時間點P-p38MAPK和TNF-α表達量均顯著增高(Plt;0.01)； SB組各時間點P-p38MAPK和TNF-α表達量又較ANP組顯著降低(Plt;0.01，表1，圖1)。

三、骨組織PTHR1 mRNA表達的變化

ANP組各時間點PTHR1 mRNA表達量均低于SO組(Plt;0.01)；SB組各時間點PTHR1 mRNA表達量較ANP組均明顯上調(Plt;0.01，表1，圖2)。

表1 3、6、12 h各組骨組織中P-p38MAPK、TNF-α和PTHR1mRNA含量及血清鈣水平

注：與SO組比較，*Plt;0.01；與ANP組比較，△Plt;0.05，#Plt;0.01

圖1 制模后6 h骨組織中P-p38MAPK和TNF-α表達

A為PTHR1擴增曲線，B為融解曲線的單峰圖(a為PTHR1，b為β-actin)

圖2實時RT-PCR產物特異性驗證

討 論

p38MAPK信號轉導通路在機體應激和炎癥反應調控過程中具有極其重要作用，是調控炎癥細胞因子產生的重要通路之一[5]。應激和各種刺激因素如各種炎癥細胞因子、生長因子、體液滲透壓改變、氧自由基、低氧血癥、休克和感染等均可激活胞質的p38MAPK；p38MAPK激活后進入胞核內，調節效應基因的表達，包括各種炎癥細胞因子基因，使介導炎癥細胞因子大量釋放。抑制p38MAPK活化阻斷該通路，可抑制炎癥細胞因子的產生。Chen等[6]研究表明，ANP時胰腺組織活化的p38MAPK和細胞因子表達量明顯升高，抑制ANP大鼠p38MAPK的活化，可減少炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β釋放。Samuel等[7]和Denham等[8]均得出相同結論。本實驗結果顯示，應用p38MAPK特異抑制劑SB203580干預ANP大鼠，能抑制p38MAPK的活化，下調骨組織TNF-α的表達，進一步證實了上述觀點。

我們前期研究證實：由于細胞因子的大量釋放，ANP大鼠抑制骨、腎PTHRmRNA表達，降低PTH及受體功能，產生低鈣血癥[1，9]；應用甲強龍治療ANP大鼠，可使細胞因子水平顯著下降，PTHR1mRNA表達顯著上調，低鈣血癥得到明顯改善[10]。本實驗應用p38MAPK特異抑制劑SB203580預處理ANP大鼠后，骨組織TNF-α表達明顯下降，骨組織PTHR1mRNA和血清鈣明顯升高，表明是p38MAPK信號轉導通路介導了ANP低鈣血癥的發生。

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[7] Samuel I,Zaheer A,Fisher RA.In vitro evidence for role of ERK,p38,and JNK in exocrine pancreatic cytokine production.J Gastrointest Surg,2006,10:1376-1383.

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[9] 黃鶴光,冷希圣.重癥急性胰腺炎大鼠骨組織甲狀旁腺素受體mRNA的表達.中華實驗外科雜志,2001,18:303-304.

[10] 周一農,黃鶴光.甲強龍對重癥急性胰腺炎大鼠低鈣血癥和甲狀旁腺激素受體表達的影響.中華實驗外科雜志,2006,23:567-569.

2008-07-14)

(本文編輯：屠振興)

Effectofp38mitogen-activatedproteinkinaseonhypocalcaemiaofratswithacutenecrotizingpancreatitis

FANGYong-mu,HUANGHe-guang,ZHOUYi-nong.

DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China

HUANGHe-guang,Email:hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathway in hypocalcaemia and parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsSeventy-two male health adult Sprague-Dawley rats were randomized into three groups: ANP group, ANP treated with SB203580 group (SB group), sham operation group (SO group). Every group was sub-divided into 3, 6, 12 h group with 8 rats in each one. ANP model was induced by retrograde infusion with 5% sodium taurocholate solution into the biliopancreatic duct. In the SB group, rats were treated with the specific p38MAPK inhibitor: SB203580 30 minutes before the induction of ANP model. The serum level of calcium was determined, the change of phosphorylated p38MAPK and TNF-alpha were measured by western blot and the expression of PTHR1mRNA was determined by quantitative real time RT-PCR.Results6 h after ANP model induction, the serum levels of calcium in ANP, SB and SO group were (2.50±0.08)mmol/L, (2.11±0.06)mmol/L and (2.35±0.10)mmol/L,respectively;the expression levels of phosphorylated p38MAPK in bone tissue were 0.14±0.04, 0.80±0.06 and 0.33±0.05, respectively; the expression levels of p38MAPK TNF-alpha were 0, 0.91±0.04 and 0.44±0.03, respectively; the expression levels of PTHR1 mRNA were 1.00±0.12, 0.23±0.04 and 0.44±0.06, respectively. The expression levels of p38MAPK and TNF-α in SB group were significantly lower than those in the ANP group (Plt;0.01); while the expression levels of PTHR1 mRNA and calcium were significantly higher than those in the ANP group (Plt;0.01).ConclusionsP38MAPK signal transduction pathway may mediate the development of hypocalcaemia in the course of ANP, and hypocalcaemia could be improved by blocking this pathway.

Pancreatitis, acute necrotizing; p38 Mitogen-activated protein kinases; Hypocalcaemia; Receptors, parathyroid hormone; Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.010

福建省教育廳科研基金(JA03099)

350001 福州,福建醫科大學附屬協和醫院普外科

黃鶴光，Email: hhuang2@yahoo.com.cn