熱休克蛋白70在賽來昔布聯(lián)合熱療治療胰腺癌中的作用

劉麗燕 王興鵬 姜立新 吳愷 楊佳芳

熱休克蛋白70在賽來昔布聯(lián)合熱療治療胰腺癌中的作用

劉麗燕 王興鵬 姜立新 吳愷 楊佳芳

熱休克蛋白(HSP) 又被稱為是“伴侶蛋白”，它在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等功能方面發(fā)揮重要作用，在多種腫瘤細(xì)胞表面都有它過度表達(dá)的現(xiàn)象[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HSP參與機(jī)體特異的抗腫瘤免疫反應(yīng)[1]，且HSP表達(dá)量與腫瘤免疫原性強(qiáng)弱密切相關(guān)[2]，與腫瘤的惡性程度及患者的預(yù)后密切相關(guān)[3]。

我們前期的研究證實(shí)，熱療聯(lián)合賽來昔布可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，抑制移植瘤的生長[4]。本文報(bào)道HSP70在熱療聯(lián)合賽來昔布治療胰腺癌中所起的作用。

一、材料與方法

1．HSP70蛋白檢測：人胰腺癌細(xì)胞株SW1990細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后分為4組：對(duì)照組、熱療組、賽來昔布組及熱療聯(lián)合賽來昔布組(聯(lián)合組)。處理方法同我們以前報(bào)道[4]。熱療為細(xì)胞置44℃ 1 h，賽來昔布終濃度為100 μmol/L。培養(yǎng)24 h后胰酶消化，離心收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，行Werstern blotting。以β-actin作為內(nèi)參。小鼠抗人HSP70單抗1∶200稀釋，小鼠抗人β-actin單抗1∶200稀釋。

2．HSP70 mRNA檢測：收集上述各組細(xì)胞，常規(guī)提取總RNA。按逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒說明書操作。引物序列：HSP70上游5′-CAGGTGATCAACGACGGAGACA-3′，下游5′-GTCGATCGTCAGGATGGACACG-3′，擴(kuò)增片段365 bp；內(nèi)參GAPDH上游5′-GTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴(kuò)增片段223 bp。先逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，后行PCR反應(yīng)。PCR參數(shù)：94℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃(HSP70)或58℃(GAPDH)30 s，72℃延伸1 min。25個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物置1.5%瓊脂糖凝膠電泳。采用美國GeneGenius凝膠電泳成像系統(tǒng)觀測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3．移植瘤組織HSP70蛋白表達(dá)的檢測：裸鼠胰腺癌移植瘤制備及分組同我們以前報(bào)道[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠取移植瘤組織，常規(guī)固定、包埋、切片、免疫組化染色，光鏡下觀察。

4．移植瘤組織HSP70 mRNA 檢測：收集上述各組移植瘤組織，常規(guī)抽提總mRNA，同上述RT-PCR方法檢測HSP70 mRNA表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

二、結(jié)果

1．SW1990細(xì)胞HSP70 mRNA和蛋白的表達(dá)：各組均有HSP70mRNA和蛋白的表達(dá)，但熱療組和聯(lián)合組較賽來昔布組及對(duì)照組增強(qiáng)(圖1、2)。

2．裸鼠移植瘤組織HSP70 mRNA和蛋白的表達(dá)：各組腫瘤組織均見HSP70 mRNA和蛋白的陽性表達(dá)，其中熱療組和聯(lián)合組的表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組和賽來昔布組(圖3、4)。

圖1對(duì)照組(1)、賽來昔布組(2)、熱療組(3)和聯(lián)合組(4)SW1990細(xì)胞HSP70 mRNA的表達(dá)

圖2對(duì)照組(A)、賽來昔布組(B)、熱療組(C)和聯(lián)合組(D)SW1990細(xì)胞HSP70蛋白的表達(dá)

圖3對(duì)照組(1)、賽來昔布組(2)、熱療組(3)和聯(lián)合組(4)裸鼠移植瘤HSP70 mRNA的表達(dá)

圖4對(duì)照組(A)、賽來昔布組(B)、熱療組(C)和聯(lián)合組(D)移植瘤組織HSP70蛋白表達(dá)(免疫組化 ×400)

討論近年來的研究顯示，HSP70與抗腫瘤活性密切相關(guān)，其免疫機(jī)制表現(xiàn)為[5]：(1)HSP70與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原肽結(jié)合形成多肽復(fù)合物，通過抗原提呈細(xì)胞 (樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)表面的特異性高親和受體，介導(dǎo)抗原肽進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞，與胞內(nèi)MHC分子形成復(fù)合物，并在抗原提呈細(xì)胞表面呈現(xiàn)，被α、βT細(xì)胞識(shí)別，激發(fā)抗腫瘤細(xì)胞特異性反應(yīng)。HSP70還可以促進(jìn)Th細(xì)胞向Thl細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)整腫瘤患者機(jī)體的免疫狀態(tài)；(2)通過激活CTL(CD8+)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞；(3)NK細(xì)胞無需致敏、補(bǔ)體激活和抗原誘導(dǎo)，可以通過識(shí)別MHC類樣分子(如HSP70家族蛋白)而發(fā)揮作用，還可以通過細(xì)胞毒性作用殺傷一些腫瘤細(xì)胞[6]；(4)HSP70可作為抗原遞呈分子，將腫瘤抗原呈遞到細(xì)胞表面，使γ、δT細(xì)胞活化，從而發(fā)揮殺傷細(xì)胞效應(yīng)；(5)通過誘導(dǎo)PBMCs和γ、δT細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-8、IFN-γ)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長及殺傷腫瘤細(xì)胞的目的[7]；(6)HSP70還可以活化補(bǔ)體系統(tǒng)，發(fā)揮抗腫瘤的作用。

本研究結(jié)果顯示，熱療組和熱療聯(lián)合賽來昔布組HSP70mRNA和蛋白的表達(dá)較賽來昔布組及對(duì)照組明顯上調(diào)。因HSP表達(dá)量多少與腫瘤免疫源性強(qiáng)弱密切相關(guān)[2]，HSP表達(dá)越多，其免疫源性越強(qiáng)，則其誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)相應(yīng)越明顯，提示在熱療組和聯(lián)合組中HSP70的高表達(dá)通過上述機(jī)制誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)也相對(duì)更強(qiáng)，這可能是賽來昔布對(duì)胰腺癌熱療協(xié)同殺傷作用的一個(gè)機(jī)制。

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[2] Melcher A,Todryk A,Hardwick N,et al.Tumor immumogenicity is determined by the mechanism of cell death via induction heat shock protein expression.Nat Med,1998,4:581-587.

[3] 王群偉,楊竹林,李永國,等.胰腺癌細(xì)胞中HSP70和HSP60表達(dá)及意義.中華中西醫(yī)雜志,2003,4:10-11.

[4] 劉麗燕，王興鵬，姜立新,等.賽來昔布聯(lián)合熱療治療胰腺癌的研究.中華胰腺病雜志，2008，8:31-34.

[5] Ciupitu AM,Petersson M,Kono K,et al.Immunization with heat shock protein 70 from methlcholanthrene-induced sarcomas induces tumor protection correlating with in vitro T cell response.Cancer Immunol Immunother,2002,51:163-170.

[6] Casey DG,Lysaght J,James T,et al.Heat shock protein derived from a non-autologous tumour can be used as an anti-tumour vaccine.Immunology,2003,110:105-111.

[7] 王笑虹，苗迎秋，宋光.熱休克蛋白70生物學(xué)功能研究的新進(jìn)展.大連大學(xué)學(xué)報(bào),2003,24:103-105.

2008-08-29)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.017

200080 上海，上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科(劉麗燕、吳愷、楊佳芳)；同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第十人民醫(yī)院消化科(王興鵬)；上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院B超室(姜立新)

王興鵬，Email：xpwcn@public7.sta.net.cn