體外侵襲和化療干預富集PANC1中CD24+CD44+細胞群的初步研究

沈俊 王敏 劉文松 秦仁義

體外侵襲和化療干預富集PANC1中CD24+CD44+細胞群的初步研究

沈俊 王敏 劉文松 秦仁義

腫瘤由異質性的腫瘤細胞組成，其中包含一個在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和耐藥中起關鍵作用的亞群——腫瘤干細胞[1]。近年根據腫瘤干細胞理論分選到了胰腺癌干細胞(CD24+CD44+ESA+)[2]，而且從胰腺癌細胞系PANC1中分離的CD24+CD44+細胞具有高致瘤性[3]。本實驗探討從胰腺癌細胞系PANC1中富集CD24+CD44+細胞的方法，為進一步研究這種細胞的生物學特性提供足量的細胞。

一、材料與方法

1．胰腺癌細胞株PANC1及分組：胰腺癌細胞株PANC1及NIH3T3 細胞株由武漢同濟醫(yī)院膽胰外科實驗室提供。常規(guī)培養(yǎng)，每48 h胰酶消化傳代1 次。PANC1細胞分為4組：對照組、高侵襲性細胞(PANC1-H)組、低侵襲性細胞(PANC1-L)組和吉西他濱耐藥組。對照組為常規(guī)培養(yǎng)24 h的PANC1細胞。取對數(shù)生長期的NIH3T3細胞制備趨化因子。

2．PANC1-H和PANC1-L細胞的獲?。翰捎肨ranswell小室方法篩選。Transwell小室購自美國Coster公司。RPMI-1640稀釋人工基質Matrigel膠(美國Sigma公司)到1 mg/ml，均勻涂布于濾膜上，加入少量無血清的培養(yǎng)基水化，采用紫外線照射殺菌。Transwell小室的下室加入適量含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液以及500 μl趨化因子，上室中加入1 ml無血清RPMI-1640懸浮的對數(shù)生長期PANC1細胞(500～1000個)，常規(guī)培養(yǎng)6、12 h后用0.25%胰酶將穿膜細胞消化下來[3]，為高侵襲性細胞(PANC1-H)，上室中為低侵襲性細胞(PANC1-L)。

3．吉西他濱耐藥細胞的獲?。篜ANC1細胞中分別加入含鹽酸吉西他濱(美國禮來公司)濃度為10 nmol/ml、100 nmol/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，獲取的細胞為吉西他濱耐藥性細胞。

4．CD24+CD44+細胞分析：取上述各組細胞，PBS洗2遍后用PBS重懸，調整細胞濃度為(0.5～1)×106/ml。取20 μl細胞懸浮液，分別加入抗體CD24-PE、CD44-APC 37℃孵育30 min，PBS洗2遍后用300 μl PBS重懸，流式細胞儀檢測。采用PBS代替一抗作為對照。實驗重復3次。

二、結果

PANC1-H 6、12 h組、PANC1-L 6、12 h組、吉西他濱10 nmol/ml、100 nmol/ml組和對照組中CD24+CD44+細胞的比例分別為 (26.1±0.3)%、(17.4±0.4)%、(26.4±0.4)%、(23.7±0.9)%、(50.3±0.4)%、(69.9±0.5)%和(31.7±0.3)%(圖1)。PANC1-H與PANC1-L組中CD24+CD44+細胞的比例無顯著差異，隨著培養(yǎng)時間延長也沒有發(fā)生顯著變化(P值均gt;0.05)；相反，吉西他濱10 nmol/ml、100 nmol/m處理可使CD24+CD44+細胞比例從31.4%～32.0%提高到69.4%～70.4%(圖2)，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。

討論目前得到的腫瘤干細胞主要是通過表面分子表型來確定的。在腫瘤干細胞分選過程中用胰酶消化腫瘤細胞成單細胞，可能會對細胞表面分子標志的狀態(tài)及細胞內的基因表達調控產生一定程度的干擾，而且會對腫瘤干細胞造成極大損傷，不適合于對其更深入研究。胰腺癌細胞系PANC1的研究相對于原代細胞來說[4]，雖然在分選過程中也會受到影響不能確保其原有生物學特性，但容易獲得，而且無正常組織細胞干擾。近年發(fā)現(xiàn)，PANC1中的CD24+CD44+細胞有高致瘤性，是胰腺癌干細胞的候選細胞之一。腫瘤干細胞具有高侵襲能力和抗化學藥物的能力[5]。為尋找富集CD24+CD44+細胞的方法，本研究采用了侵襲模型和化療抵抗兩種方法，并進行比較。

圖1PANC1-H 6(A)、12 h組(B)、PANC1-L 6(C)、12 h組(D)和對照組(E)流式細胞檢測CD24+CD44+細胞含量

圖2對照組(A)、吉西他濱10 nmol/ml組(B)和100 nmol/ml組(C)流式細胞檢測CD24+CD44+細胞含量

Transwell小室體外侵襲模型通過模擬體內侵襲能力較強的腫瘤細胞能夠脫離原位腫瘤細胞群體，分泌基質蛋白溶解酶降解細胞外基質(ECM)成分——Matrigel膠,在某特異器官或組織(NIH3T3無血清培養(yǎng)上清)的趨化下發(fā)生侵襲過程。腫瘤細胞可通過Matrigel層,非轉移性腫瘤細胞、成纖維細胞、表皮細胞不能通過[6]。應用該法可鑒定細胞的侵襲能力。本實驗通過Transwell小室篩選出高侵襲性的PANC1胰腺癌細胞，但CD24+CD44+細胞僅占26%左右，且與低侵襲性的PANC1胰腺癌細胞及原代PANC1細胞中的CD24+CD44+細胞比例無顯著差異，提示Transwell小室腫瘤侵襲模型不適合用來富集大量的CD24+CD44+細胞。這可能因為腫瘤細胞體內侵襲過程至少包括運動因子、黏附分子、趨化因子、胞外基質降解酶和血管形成因子5類因子參與穿越腫瘤血管內皮和基底膜進入循環(huán)[7]，而Transwell小室體外侵襲模型只能通過降解Matrige膠模擬胞外基質降解酶和趨化因子的趨化作用，不能完全代替腫瘤細胞在體內環(huán)境下的侵襲過程，達不到富集CD24+CD44+細胞的目的。

本實驗又采用化療藥物鹽酸吉西他濱作用于PANC1胰腺癌細胞系，檢測耐藥癌細胞中CD24+CD44+細胞的含量，結果顯示，CD24+CD44+細胞比例提高到50%以上，且隨著鹽酸吉西他濱濃度升高，CD24+CD44+細胞比例也有所提高，提示鹽酸吉西他濱化療干預是一種篩選富集胰腺癌細胞系PANC1中CD24+CD44+細胞較好方法。

[1] Reya T,Morrison SJ,Clarke MF,et al.Stem cells,cancer,and cancer stem cells.Nature,2001，414:105-111.

[2] Li C,Heidt DG,Dalerba P,et al.Identification of pancreatic cancer stem cells.Cancer Res,2007,67:1030-1037.

[3] 譚曉潔,侯建國,賀松琴,等.采用體外侵襲實驗分離侵襲性人原代腎細胞癌細胞.第二軍醫(yī)大學學報,2006,3:318-321.

[4] 李錦軍,顧健人.癌干細胞研究進展.生命科學,2006,18:333-339.

[5] Huang P,Wang CY,Gou SM，et al.Isolation and biological analysis of tumor stem cells from pancreatic adenocarcinoma.World J Gastroenterol,2008，14:3903-3907.

[6] Terranova VP,Hujanen ES,Loeb DM,et al.Use of a reconstituted basement membrane to measure cell invasiveness and select for highly invasive tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA,1986,83:465-469.

[7] Kohn EC,Liotta LA.Molecular insights into cancer invasion:strategies for prevention and intervention.Cancer Res,1995,55:1856-1862.

2008-12-10)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.021

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