外周血K-ras基因突變檢測在胰腺癌診斷中的應用

林寒 李兆申 高軍 龔燕芳 金晶

·論著·

外周血K-ras基因突變檢測在胰腺癌診斷中的應用

林寒 李兆申 高軍 龔燕芳 金晶

目的檢測胰腺癌患者外周血K-ras基因第12、13密碼子突變，探討其對胰腺癌的診斷價值。方法選取經病理證實的胰腺癌患者54例以及健康志愿者33例。抽取全部實驗者外周血標本，抽提循環中的DNA，應用肽核酸鉗制實時定量PCR法檢測K-ras基因突變，并分析其與患者臨床病理參數的相關性。結果54名胰腺癌患者中，40例(74.1%)外周血標本可檢測出K-ras基因第12或13密碼子突變。33名健康志愿者外周血標本無一例檢出K-ras基因突變。外周血中K-ras基因的突變與患者年齡、淋巴血管侵犯、腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期、CA19-9水平有關(Plt;0.05)，而與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小及病理類型無關。結論肽核酸鉗制實時定量PCR法檢測外周血K-ras基因突變的敏感性高。外周血K-ras基因突變的檢出提示腫瘤具有高侵襲性，可能預后不良。

胰腺腫瘤； 肽核酸類； K-ras基因； 血液循環

研究表明，75%～100%的胰腺癌發生K-ras基因第12或13密碼子突變[1]。臨床可獲得的檢測標本包括手術切除的腫瘤組織、內鏡超聲引導下的細針穿刺活檢組織或細胞以及胰液、十二指腸液、外周血及糞便等等。其中腫瘤組織的K-ras基因突變陽性檢出率最高[2]，其次是胰液[3]，但組織標本為有創性檢查，胰液收集操作復雜，部分患者無法耐受，而外周血及糞便DNA的檢測具有簡便、可重復性強、無創傷等優點。既往有研究認為，外周血及糞便中的K-ras基因檢測陽性率較低，特異性不高，考慮原因與外周血及糞便DNA的抽提技術，以及K-ras基因檢測方法不夠靈敏有關。

本室前期建立了肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)鉗制實時定量PCR法檢測K-ras基因第12、13密碼子突變[4]，敏感性高達0.001%。本文應用該法檢測胰腺癌患者外周血K-ras基因突變，探討其對胰腺癌的診斷價值。

材料與方法

一、臨床標本

選取2006年至2007年上海長海醫院住院的經病理證實的胰腺癌患者54例，經過患者及家屬知情同意及倫理委員會通過后，抽取患者外周血，根據常規血細胞DNA抽提方法[5]抽提循環血的DNA，置-20℃保存。以33例健康志愿者血標本為對照。

二、對照質粒的構建

根據文獻報道，BxPC3細胞含野生型K-ras基因，第1外顯子第12、13密碼子序列為GGTGGC，PANC1細胞K-ras基因第12密碼子突變，序列為GATGGC，SW1990細胞K-ras基因第13密碼子突變，序列為GGTGAC。本室從中國科學院細胞所購得以上3種胰腺癌細胞株。常規復蘇、培養。收集細胞、抽提細胞DNA。用PCR方法分別擴增出K-ras野生型及突變型的DNA片段，以pTA2質粒為載體，分別構建出野生型、第12密碼子突變型及第13密碼子突變型質粒，作為PCR檢測的陰性、陽性對照。

三、K-ras基因第12、13密碼子突變檢測

應用我室前期建立的PNA鉗制實時定量PCR法檢測K-ras基因第12、13密碼子突變。引物序列：上游，5′-TACTGGTGGAGTATTTGATA-3′；下游，5′-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3′。PNA序列：NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-HAc。反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性15 s，70℃ PNA結合10 s，60℃引物退火及延伸1 min。擴增40循環，在每一循環的60℃步驟末收集熒光信號。反應結束后進行融解曲線分析：95℃持續15 s，冷卻至65℃保持1 min，并以0.3℃/s的速度逐漸升溫至95℃持續15 s。通過儀器自帶軟件自動分析出Ct值。對于PNA抑制下無擴增的模板，進行常規PCR擴增，確定樣品中DNA模板的完整性。每一份樣品檢測3次。

根據前期的實驗結果[4]，野生型與突變型基因的融解溫度(tm值)分別為(83.5±0.5)℃及(80.8±0.6)℃。當tm值為(80.8±0.6)℃時，判定標本含突變型基因，當tm值為(83.5±0.5)℃時，標本含野生型基因。

四、統計學分析

K-ras基因突變與患者臨床病理參數的相關性行χ2檢驗。所有的統計學分析均使用SPSS13.0軟件，P值lt;0.05認為有統計學意義。

結 果

一、外周血DNA的K-ras基因突變率

54例胰腺癌血液標本中有40例K-ras基因發生突變，突變率為74.1%。突變拷貝數占總拷貝數的0.15%～12.04%。健康志愿者均為野生型K-ras。

二、K-ras基因突變與臨床病理參數的關系

胰腺癌患者外周血中K-ras基因的突變與患者年齡、淋巴及血管侵犯、腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期、血CA19-9水平等有關，而與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小及病理類型無關(表1)。

表1 K-ras基因突變與臨床病理參數間的相關性

討 論

近年研究表明，許多惡性腫瘤細胞內的DNA會出現在血清或血漿之中。Leon等[6]及Shapiro等[7]檢測了正常人及消化道良、惡性疾病患者的血漿游離DNA水平，正常人血漿DNA含量平均是13 ng/ml，良、惡性疾病患者分別是118 ng/ml和412 ng/ml，胰腺癌患者可高達650 ng/ml。血漿中突變的基因型多與原發灶的突變類型一致，猜測可能是血循環中破碎的腫瘤細胞釋放的DNA[8]。因此，通過檢測外周血DNA的基因型或突變來診斷腫瘤是一個值得探討的領域。

K-ras基因的點突變是與胰腺癌發生、發展關系最為密切的癌基因之一[9-10]。K-ras基因點突變檢測對于胰腺癌診斷是十分有意義的。既往研究顯示，外周血K-ras基因突變檢測的特異性較高，但敏感性卻差強人意[11-12]。Rodolfo等[13]用傳統的RFLP-PCR同時檢測胰腺癌患者胰腺組織及血液標本，其中腫瘤組織的K-ras基因突變率高達70%，而相應的外周血DNA的K-ras基因突變率卻為0。Dabritz等[14]報道的特異性探針聯合PNA鉗制PCR法檢測血漿DNA中K-ras基因突變率亦僅為36%。本組結果顯示，應用PNA鉗制實時定量PCR法檢測胰腺癌患者外周血DNA中K-ras基因第12、13密碼子突變，突變率高達74.1%，而健康人中無一例K-ras基因突變。這一結果得益于本實驗應用的檢測方法。傳統的RFLP-PCR等檢測方法敏感性較低；選用針對K-ras基因第12密碼子的Taqman探針進行PNA鉗制實時定量PCR法檢測，雖然特異性高，但是一種探針只能檢測第12或13密碼子的一種類型的突變，而在同一腫瘤標本中也可能存在多種類型的突變[15]；本實驗選擇SYBR Gree Ⅰ作為熒光染料，可同時檢測第12、13密碼子任意一種突變，從而提高了檢測的敏感性。本實驗結果還顯示，外周血中K-ras基因的突變與年齡、淋巴血管侵犯、腫瘤分化程度、血CA19-9水平具有顯著的相關性，提示外周血K-ras基因突變在一定意義上表示腫瘤具有高侵襲性，是預后不良的因素之一。

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2009-04-23)

(本文編輯：屠振興)

Screeningforpancreaticcancerbypeptidenucleicacid-mediatedone-stepK-rasmutationdetectionassay

LIN Han, LI Zhao-shen, GAO Jun, GONG Yan-fang, JIN Jing.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

LIZhao-shen,Emailzhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the diagnostic value of determination of the genotypes in codon 12 and 13 of K-ras oncogene in blood samples of patients with pancreatic carcinoma (PC).MethodsBlood samples were obtained from 54 patients with pathologically confirmed PC, and 33 healthy controls. The DNAs were obtained in these samples, and then genotype of K-ras mutation was detected by using the PNA-clamping real-time quantitative PCR. Then the correlation between the K-ras genotypes of blood DNA and the clinical characteristics was analyzed.ResultsK-ras mutations were found in 74.1% (40/54) of patients with PC. There was no such mutation in control samples. The mutations of K-ras was associated with age, lymph node and vessel invasion, poorly differentiated tumor, CA19-9, while it was not associated with sex, tumor location, size of tumor, clinical staging and pathological type.ConclusionsThe one-step method was highly sensitive for detecting K-ras mutation in blood samples. Detection of circular blood cells harboring K-ras mutation suggested the tumor was highly invasive with poor prognosis.

Pancreatic neoplasms； Peptide nucleic acids； K-ras gene； Blood circulation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.008

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申, Email：zhsli@81890.net