MUC2基因甲基化在胰腺癌細胞株、胰腺癌患者外周血中的檢測及意義

薄陸敏 李兆申 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶

·論著·

MUC2基因甲基化在胰腺癌細胞株、胰腺癌患者外周血中的檢測及意義

薄陸敏 李兆申 高軍 龔燕芳 吳紅玉 金晶

目的檢測MUC2基因在胰腺癌細胞株、胰腺癌患者外周血中的甲基化情況，探討MUC2基因甲基化對胰腺癌早期診斷的價值。方法收集長海醫院消化內科實驗室保存的人胰腺癌細胞系SW1990、ASPC、PANC1、BxPC3、PaTu8988、CFPAC1及40例胰腺癌、15例慢性胰腺炎患者和25例正常對照者外周血標本，應用甲基化敏感性限制性內切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)為基礎的PCR法檢測MUC2基因甲基化。結果人胰腺癌細胞系PANC1、BxPC3、PaTu8988未發生MUC2基因甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990胰腺癌細胞系發生MUC2基因甲基化。外周血標本中，40例胰腺癌標本甲基化率為40.0%(16例)，15例慢性胰腺炎無甲基化，25例正常對照甲基化率4.0%(1例)。胰腺癌與慢性胰腺炎、正常對照之間的甲基化率有顯著差異(Plt;0.01)。外周血標本MUC2基因啟動子CpG島甲基化檢測診斷胰腺癌的敏感性為40%、特異性為97.5%、診斷準確性68.8%、陽性預測值94.1%、陰性預測值61.9%。結論用甲基化限制性酶切PCR法對外周血進行MUC2基因啟動子區高甲基化檢測可望成為新的胰腺癌診斷的重要實驗室輔助手段。

胰腺腫瘤； 甲基化； MUC2基因； 聚合酶鏈反應

近年來DNA甲基化成為腫瘤研究的熱點，它是人類后成論學說的主要復制后修飾方式[1-2]，通常發生在胞嘧啶和鳥嘌呤的CpG二核苷酸中的胞嘧啶5位碳原子上。MUC2屬于分泌型粘蛋白，在多種腫瘤，包括胰腺癌中異常表達，這與其啟動子區CpG島高甲基化相關。有研究顯示，結直腸癌細胞中MUC2表達抑制與基因啟動子區CpG島高甲基化相關[3-5]。本實驗分析胰腺癌細胞株、胰腺癌患者外周血中MUC2基因的甲基化情況，探討其對胰腺癌臨床診斷的價值。

材料與方法

一、胰腺癌細胞系

SW1990購于美國ATCC公司，ASPC、BxPC3、CFPAC1、PANC1購自中國科學院細胞所，PaTu8988由德國Marburg市Philipps大學細胞生物學和分子病理學研究所Elsasser博士惠贈。常規培養傳代。收集細胞，采用酚/氯仿法抽提細胞DNA。

二、外周血標本

取自2006年5月至2006年11月第二軍醫大學附屬長海醫院住院的胰腺癌患者40例，慢性胰腺炎(CP)患者15例。胰腺癌中29例由病理學診斷為導管腺癌，11例經臨床表現、實驗室檢查、影像學MRI及ERCP檢查等確診，其中男24例，女16例，年齡38～79歲，平均53.2歲。CP診斷參照慢性胰腺炎診治指南(2005年，南京)的標準，其中男10例，女5例，年齡36～68歲，平均48.6歲。25例正常對照來自長海醫院消化內科(均排除其他腫瘤疾病)。所有病例均有較完整的臨床資料。

將1 ml EDTA抗凝血加入1 ml磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，3500 g離心15 min,傾去含裂解紅細胞上清，重復一次；用0.7 ml TE混懸沉淀物，37℃水浴溫育1 h；加入1 mg/ml蛋白酶K 0.2 ml,上下轉動試管。待液體變黏稠后置50℃水浴保溫3 h，酚/氯仿法抽提DNA。

三、MUC2基因甲基化檢測

抽提的DNA采用DNA純化試劑盒(上海天根生物科技公司)純化，分別應用HpaII、MSPI酶切。酶切反應體系：模板DNA 0.5 μl/100 ng，10×T Buffer 3 μl，0.1% BSA 3 μl，HindⅢ 1 μl，MspI/HpaⅡ 2 μl/20U，ddH2O 20.5 μl。置37℃ 水浴 4 h，75℃ 20 min終止反應，普通DNA純化試劑盒進行純化，洗脫液EB 20 μl洗脫DNA，-20℃保存。設未經酶切的DNA作為對照，根據JENNY J等設計的引物序列，由上海生物工程公司合成。MUC2引物上游：5′-TGTGTTGGCATTCAGGCTAC-3′，下游：5′-GCAGGGGCGGTGTGGGTT-3′，擴增片段259 bp。PCR擴增反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、61℃ 40 s、72℃ 40 s，30個循環；最后72℃ 10 min。PCR產物行2%瓊脂糖凝膠電泳。

HpaⅡ為甲基化敏感酶，不能識別甲基化的CmCGG序列；MspI為甲基化非敏感酶，可識別甲基化的CmCGG序列。PCR擴增后出現259 bp條帶時為MUC2基因啟動子甲基化，反之則為非甲基化。

四、統計學處理

SPSS軟件包處理數據，Fisher精確檢驗計算P值，Plt;0.05為差異有顯著性。

結 果

一、胰腺癌細胞株MUC2基因甲基化狀態

所有胰腺癌細胞株未經MspⅠ/HapⅡ限制性酶切前均可擴增出259 bp大小的條帶。經甲基化非敏感性酶MspⅠ酶切后，特異性PCR產物均消失。PANC1、BxPC3、PaTu8988經甲基化敏感性酶HapⅡ酶切后，特異性PCR產物消失，表明MUC2基因未發生甲基化；ASPC、CFPAC1、SW1990經HapⅡ酶切后仍可擴增出259 bp大小的條帶，表明MUC2基因發生甲基化(圖1)。

二、胰腺癌患者外周血MUC2基因甲基化狀態

40例胰腺癌患者血標本的MUC2基因甲基化率為40.0%(16/40)，15例CP患者血MUC2基因無甲基化，25例正常對照者的血MUC2基因甲基化率為4.0%(1/25)。胰腺癌與CP、正常對照組之間的MUC2基因甲基化率有顯著差異(Plt;0.01，圖2)。外周血標本MUC2基因啟動子CpG島甲基化檢測診斷胰腺癌的敏感性為40%、特異性為97.5%、診斷準確性68.8%、陽性預測值94.1%、陰性預測值61.9%。以CA19-9gt;37 μ/ml診斷胰腺癌，則診斷的敏感性為65.0%、特異性為85%、診斷準確性75%、陽性預測值81.3%、陰性預測值70.8%。外周血標本MUC2基因甲基化檢測與CA19-9相比，可提高診斷的特異性和陽性預測值，而在診斷敏感性和準確性方面無顯著差異。

討 論

由于胰腺癌在臨床上缺乏特異表現，影像學檢查和腫瘤標記物如CA19-9又很難在早期發現腫瘤，就診時3/4的患者已屬晚期，手術可切除率僅為4%～27%，5年生存率小于5%。因此，發展新的篩選手段、綜合分析高危人群和提高胰腺癌的早期診斷率，是改善預后的關鍵。

C：未酶切的擴增條帶；M：經MspⅠ酶切后的擴增條帶；H：經HapⅡ酶切后的擴增條帶

圖16株胰腺癌細胞株MUC2基因甲基化的檢測結果

M： marker；C：未經酶切的擴增條帶；M：經MspⅠ酶切后的擴增條帶；H：經HapⅡ酶切后的擴增條帶

圖26例胰腺癌患者血MUC2基因甲基化擴增產物圖

生理狀態下，DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育過程中起著極其重要的作用。甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素。目前腫瘤的基因甲基化研究主要集中在抑癌基因，這是因為人們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化有關。由于CpG島發生甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發生的早期預測[6]。

DNA甲基化的檢測可分為基因組整體水平的甲基化檢測、特異位點的甲基化檢測和新甲基化位點的尋找；檢測方法可分為基于PCR的甲基化分析方法、基于限制性內切酶的甲基化分析方法、基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。本課題采用以甲基化敏感性限制性內切酶(methylation-sensitive restriction endonuclease，MS-RE)為基礎的PCR法，是對特異性位點的DNA甲基化的檢測。這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不識別的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行分析。HpaⅡ和MspⅠ均能識別CCGG序列，然而當序列中的胞嘧啶發生甲基化時，HpaⅡ不識別，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進行PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態[7]。這是一種經典的甲基化研究方法，其優點是簡單,成本低廉，甲基化位點明確,實驗結果易解釋，但也同時存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題。本課題采用非待測區的內切酶HindⅢ和甲基化敏感的限制性內切酶HapⅡ同時消化DNA片段，隨后通過DNA片段純化，保留了含有甲基化區的片段，從而避免了MS-RE不完全消化引起的假陽性的問題。

MUC2屬于分泌型粘蛋白，我們前期的研究顯示人胰腺癌細胞系MUC2表達抑制與其啟動子區CpG島發生高甲基化相關。本課題通過檢測外周血標本，顯示胰腺癌與CP、正常對照之間的MUC2基因甲基化存在顯著性差異(Plt;0.01)。外周血標本MUC2基因甲基化檢測診斷胰腺癌與CA19-9相比，可提高診斷的特異性和陽性預測值。因此，外周血MUC2基因甲基化檢測有可能成為胰腺癌臨床診斷的一種實驗室輔助手段。

[1] Baylin SB,Herman JG,Graff JR,et al.Alterations in DNA methylation:a fundamental aspect of neoplasia.Adv Cancer Res,1998,72:141-196.

[2] Baylin SB.Reversal of gene silencing as a therapeutic target for cancer-roles for DNA methylation and its interdigitation with chromatin.Novartis Found Symp,2004,259:226-233.

[3] Hanski C,Riede E,Gratchev A,et al.MUC2 gene suppression in human colorectal carcinomas and their metastases:in vitro evidence of the modulatory role of DNA methylation.Lab Invest,1997,77:685-695.

[4] Riede E,Gratchev A,Foss HD,et al.Increased methylation of promotor region suppresses expression of MUC2 gene in colon carcinoma cells.Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd,1998,115:299-302.

[5] Gratchev A,Siedow A,Bumke-Vogt C,et al.Regulation of the intestinal mucin MUC2 gene expression in vivo:evidence for the role of promoter methylation.Cancer Lett,2001,168:71-80.

[6] Bird AP.CpG-rich islands and the function of DNA methylation.Nature,1986,321:209-213.

[7] Eads CA,Danenberg KD,Kawakami K,et al.MethyLight:a highthroughput assay to measure DNA methylation.Nucleic Acids Res,2000,28:E32.

2009-05-04)

(本文編輯：屠振興)

MethylationstatusofMUC2geneinpancreaticcarcinomacelllinesandperipheralbloodofpancreaticcarcinomapatients

BO Lu-min, LI Zhao-shen, GAO Jun, GONG Yan-fang, WU Hong-yu, JIN Jing.

Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

LIZhao-Shen,Emailzhsli@81890.net

ObjectiveTo analyze the methylation status of MUC2 gene in pancreatic carcinoma cell lines and peripheral blood of pancreatic carcinoma patients, and to explore the role of MUC2 methylation in the early diagnosis of pancreatic carcinoma.MethodsHuman pancreatic cancer cell lines of SW1990, ASPC, PANC1, BxPC3, PaTu8988 and CFPAC1, and 40 peripheral blood samples of pancreatic carcinoma patients, 15 cases of chronic pancreatitis, 25 cases of normal controls were collected, and the methylation status of MUC2 gene was detected by methylation sensitive restriction endonuclease PCR.ResultsMUC2 methylation was not detected in PANC1, BxPC3, PaTu8988, but was detected in ASPC, CFPAC1, SW1990. Among the peripheral blood samples, the rate of methylation in pancreatic cancer was 40.0% (n=16), in chronic pancreatitis was 0%, in normal controls was 4.0% (n=1), and the difference among the three groups was statistically significant (Plt;0.01). The methylation of MUC2 gene CpG islands for the diagnosis of pancreatic carcinoma had a sensitivity of 40%, specificity of 97.5%, accuracy of 68.8%, positive predictive value of 94.1% and negative predictive value of 61.9%．ConclusionsThe detection of MUC2 hypermethylation in peripheral blood samples may be an potential marker for early diagnosis of pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Methylation; MUC2 genes; Polymerase chain reaction

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.014

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申：Email:zhsli@81890.net