重組腸三葉因子對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜保護作用的研究

施琳琳 孟立娜 葉咸德 趙承滿 包海標

·論著·

重組腸三葉因子對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜保護作用的研究

施琳琳 孟立娜 葉咸德 趙承滿 包海標

目的探討重組腸三葉因子(rITF)對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜的保護作用及其機制。方法SD雄性大鼠60只，按隨機數字表法分為對照組、ANP組、rITF組，每組20只。逆行胰膽管注射5%牛黃膽酸鈉100 μl/100 g體重制備ANP模型。rITF組制模前后尾靜脈注射rITF 0.5 mg/100 g體重，對照組及ANP組注射等量生理鹽水，術后12、24 h分批處死大鼠。取血檢測淀粉酶含量，取末端回腸組織觀察病理學改變并予評分、免疫組化法檢測腸黏膜NF-κB活性，RT-PCR法檢測腸黏膜TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA的表達。結果ANP組和rITF組血淀粉酶水平較同時點對照組均顯著升高。ANP組腸黏膜損傷評分較同時點對照組高(Plt;0.05)；ANP 12 h組較rITF 12 h 組高(Plt;0.05)，但24 h組間評分無明顯差異。對照組、ANP組與rITF組12 h腸黏膜NF-κB陽性細胞數分別為(26±4)個、(55±8)個、(49±4)個；回腸組織TNF-α mRNA相對表達量分別為0.050±0.005、1.040±0.031和0.792±0.0256；回腸組織ICAM-1 mRNA相對表達量分別為0.045±0.010、0.795±0.037和0.400±0.031。ANP組上述各項指標值均較對照組顯著增加(Plt;0.05或Plt;0.01)，而rITF組又較ANP組均顯著減少(Plt;0.05)。結論重組腸三葉因子對ANP大鼠腸黏膜具有保護作用，其機制可能通過抑制腸黏膜NF-κB活化，下調TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達。

胰腺炎，急性壞死性； 腸黏膜； 核因子-κB； 腸三葉因子

全身炎癥反應綜合征(SIRS)及多器官功能衰竭(MOF)是重癥急性胰腺炎(SAP)患者病死的主要原因。腸道黏膜屏障受損可引發腸道細菌易位，繼發內毒素血癥，造成二次打擊，最終導致SIRS及MOF的發生[1]。因此，防治腸黏膜屏障功能障礙是治療SAP的中心環節之一。腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF)是近年來發現的一種對消化道黏膜具有保護作用的因子[2]。研究證實，SAP時腸黏膜屏障功能受損與NF-κB的活性密切相關。為此，本實驗觀察重組ITF(reorganized intestinal trefoil factor,rITF)對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠腸黏膜屏障的保護作用，并探討其可能機制。

材料和方法

一、實驗動物及分組

60只12周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，體重(300±40)g，購自中國科學院上海實驗動物中心。按隨機數字表法分為對照組、ANP組和rITF組，各20只。后兩組參考Aho法[3]，膽胰管逆行注射5%牛黃膽酸鈉溶液100 μl/100 g體重制備ANP模型。對照組僅剖腹，翻動胰腺。對照組及ANP組手術前后尾靜脈注射生理鹽水0.5 ml/100 g體重；rITF組注射rITF 5 mg/100 g體重(由北京大學蛋白質工程及植物基因工程國家重點實驗室提供)。術后12、24 h分批處死大鼠，取血檢測淀粉酶含量(自動生化分析儀測定)，取距回盲部10 cm左右的回腸組織備用。

二、腸道黏膜組織病理檢查

剪取末端回腸2 cm，常規固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，參照Chiu等[4]方法將小腸黏膜損傷分為6級進行評分。0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，并伴有毛細血管充血；2分：上皮下間隙擴大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細胞變性、壞死，少數絨毛頂端脫落；4分：上皮細胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細血管擴張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。

三、腸黏膜NF-κB活性檢測

采用快捷免疫組化MaxVisionTM法，根據MaxvisionTM試劑盒(福州邁新公司)說明書操作。兔抗鼠NF-κB p65亞單位一抗(Santa Cruz公司)1∶50稀釋。腸黏膜細胞的胞核、胞質棕褐色著色為陽性細胞，單純胞質棕褐色著色為陰性。高倍鏡下計數5個回腸橫斷面的陽性細胞數，取均數。

四、回腸組織TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA檢測

用Trizol試劑(Invitogen 公司)抽提回腸組織總RNA，采用RT-PCR法檢測TNF-α mRNA、ICAM-1mRNA。先用M-MLV逆轉錄試劑盒(Promega公司)逆轉錄合成cDNA，再以PCR擴增試劑盒(上海生物有限公司)進行擴增。TNF-α上游引物5′-CCACGTCGTAGCAAACCAC-3′，下游引物5′-TGGGTGAGGAGCACGTAGT-3′，擴增片段189 bp；ICAM-1上游引物5′-GATGCTGACCCTGGAGAGCA-3′，下游引物5′-CAGGGACTTCCCATCCACCT-3′，擴增片段409 bp；內參β-actin上游引物5′-TGGAAT-CCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物5′-TAA-AACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′，擴增產物349 bp。PCR反應條件：94℃ 30 s，55℃(TNF-α)或60℃(ICAM-1)或58℃(β-actin)30 s，72℃ 30 s，32個循環。擴增產物電泳分離后，利用GeneGenius凝膠成像分析系統進行掃描分析。以目的產物條帶和β-actin條帶的光吸收值比值表示其相對表達水平。

五、統計學分析

結 果

一、大鼠生存率

對照組大鼠全部存活；rITF 12 h組和ANP 12 h組各死亡1只；rITF 24 h組和ANP 24 h組各死亡2只。同一時間點不同組別大鼠和不同時間點的同一組別大鼠死亡率差異均無統計學意義。

二、大鼠血清淀粉酶變化

術后12 h，對照組、ANP組和rITF組血清淀粉酶分別為(723±135)U/L、(1905±286)U/L和(2836±521)U/L;24 h為(616±37)U/L、(2073±1092)U/L和(1562±755)U/L。ANP組和rITF組淀粉酶水平較同時點對照組均顯著升高(Plt;0.01)，而同時點rITF組與ANP組間無明顯差異。

三、回腸組織病理改變

對照組小腸無水腫及腸腔脹氣，鏡下見腸上皮絨毛完整，上皮細胞下無間隙，間質僅少量淋巴細胞浸潤；ANP組小腸腸壁水腫，腸腔脹氣呈管狀，腸周圍可見皂化斑，部分大鼠出現腹水，鏡下見腸道絨毛上皮細胞脫落、壞死，上皮下間隙擴大，淋巴管擴張明顯，伴有毛細血管充血，并可見較多中性粒細胞、淋巴細胞浸潤；rITF組腸壁水腫不明顯，少見腸腔脹氣及皂化斑，鏡下見腸道絨毛上皮細胞壞死較少，毛細血管少量充血明顯，淋巴管擴張不明顯，少量淋巴細胞浸潤(圖1左)。ANP組腸黏膜損傷評分較同時點對照組高(t=114.5、t=113.5，Plt;0.05，表1)；ANP 12 h組較rITF 12 h 組高(t=108.5，Plt;0.05)，24 h組間評分無明顯差異。

四、回腸黏膜NF-κB活性

術后12 h，對照組、ANP組和rITF組NF-κB陽性細胞數分別為(26±4)個、(55±8)個、(49±4)個；24 h分別為(37±9)個、(66±4)個、(40±9)個(圖1右)。ANP組較對照組明顯增加(Plt;0.01)，rITF組較ANP組明顯下降(Plt;0.05)。

五、回腸組織TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達及其與NF-κB相關性

術后12 h，對照組、ANP組和rITF組回腸組織TNF-α mRNA相對表達量分別為0.050±0.005、1.040±0.031和0.792±0.0256；24 h為0.049±0.007、1.73±0.132和0.918±0.0425(圖2)。術后12 h回腸組織ICAM-1 mRNA相對表達量分別為0.045±0.010、0.795±0.037和0.400±0.031；24 h為0.060±0.005、1.156±0.095和0.590±0.067(圖3)。ANP組TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表達均較對照組明顯增加(Plt;0.05)，而rITF組又較ANP組明顯降低(Plt;0.05)?；啬c組織TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA表達均與NF-κB活性呈正相關(r=0.919，r=0.917，Plt;0.01)。

圖1(左) 對照組(A)、ANP組(B)、rITF組(C)12 h大鼠小腸黏膜病理學改變(HE ×200)；(右)對照組(A)、ANP組(B)、rITF組(C)12 h大鼠小腸黏膜NF-κB活化(免疫組化 ×40)

表1 各組大鼠腸黏膜損傷評分

圖2 各組大鼠腸黏膜TNF-α mRNA表達

圖3 各組大鼠腸黏膜ICAM-1 mRNA表達

討 論

SAP時，腸道組織不僅是被損傷的靶器官，更是應激狀態下機體內環境穩定和全身炎癥反應的重要調節者。正常情況下，NF-κB處于抑制狀態，當機體受到炎癥因子(TNF-α、IL-1β等)、氧自由基、蛋白激酶C、病毒或細菌及其代謝產物等刺激時可激活NF-κB，NF-κB的活化又可誘導多種細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF、粒-巨噬細胞集落刺激因子等)、ICAM-1、VCAM-1、白細胞黏附分子-1、趨化因子等表達增加。

TNF-α是NF-κB下游激活的重要細胞因子之一，是SAP并發多臟器損傷的始動因子之一[5]。現已證實，TNF-α可改變腸上皮細胞的形態，使其異常表達相關黏附因子和肌動蛋白從而影響腸屏障通透性。ICAM-1在正常情況下低水平表達，但在SAP患者，血清ICAM-1含量明顯升高[6]，應用外源性ICAM-1拮抗劑可減輕實驗性ANP導致的肺損傷[7]。本實驗結果顯示，ANP大鼠早期腸黏膜NF-κB即明顯活化，同時TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA表達明顯上調。

ITF由59個氨基酸殘基構成，相對分子質量約為6700，屬三葉肽家族。ITF主要在腸道上皮細胞表達，結構穩定，不易被多種消化酶破壞，能抗酸、抗蛋白酶和抗熱分解，主要生理功能為保持腸道結構及功能上的完整，對腸道黏膜的保護和修復起重要作用。研究表明[8]，ITF具有很強的細胞保護作用，可明顯減輕多種損傷因子介導的腸黏膜損害，它不僅具有一般生長因子所具有的促進細胞增殖與移行的能力，還能同黏液糖蛋白結合，穩定腸黏液層。因而ITF 在腸道的自我保護和損傷后修復機制中占重要地位。本實驗結果顯示，ANP大鼠靜脈給予外源性rITF干預后，黏膜損傷明顯減輕，腸上皮NF-κB的活化被明顯抑制，同時TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA的表達亦較ANP組明顯下降(P均lt;0.05)，表明rITF的干預除能增加腸道表面黏液保護層和提高上皮細胞遷移外，還可能通過抑制腸上皮NF-κB的活化，下調其介導的炎性介質TNF-α和ICAM-1的過度表達，減輕級聯瀑布反應形成，從而起到保護ANP大鼠腸屏障的作用。但rITF 24 h組與ANP 24 h組腸黏膜評分無顯著差異，這可能與ITF半衰期較短有關，也可能因黏膜的恢復需要較長的時間有關，需要做進一步研究。

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2008-11-12)

(本文編輯：屠振興)

Effectofrecombinantintestinaltrefoilfactoronintestinalmucosaofacutenecrotizingpancreatitisinrats

SHI Lin-lin, MENG Li-na, YE Xian-de, ZHAO Cheng-man, BAO Hai-biao.

Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310006, China

MENGLi-na,Emailmln6713@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant intestinal trefoil factor (rITF) on the intestinal mucosa of acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats and explore the mechanism.Methods60 male SD rats were randomly divided into control group (n=20), ANP group (n=20), rITF group (n=20). ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (100 μl/100 g) into biliopancreatic duct. Rats in rITF group were injected with rITF (0.5 mg/100 g) before and after ANP induction. The rats in ANP group and control group

same amount of normal saline. Each group were sacrificed 12 h or 24 h later,respectively. Blood sample was taken to determine the serum level of amylase. Terminal ileum was resected to observe the pathologic changes; immunohistochemistry method was applied to detect the activity of NF-κB; the expression of TNF-α mRNA, ICAM-1 mRNA in intestinal mucosa was measured by RT-PCR.ResultsIntestinal injury score of ANP group was higher than that of control group (Plt;0.05), intestinal injury score of ANP 12 h group was higher than that of rITF 12 h group (Plt;0.05), but there was no significant difference between ANP 24 h group and rITF 24 h group. The number of positive NF-κB cells was 26±4, 55±8, 49±4,respectively; the relatively expression of TNF-α mRNA in terminal ileum was 0.050±0.005, 1.040±0.031 and 0.792±0.0256, respectively; the relatively expression of ICAM-1 mRNA was 0.045±0.010, 0.795±0.037 and 0.400±0.031, respectively, in control group, ANP group and rITF 12 h group. The corresponding values in the ANP group were significantly increased compared with those values in the control group (Plt;0.05 orPlt;0.01).ConclusionsrITF may protect the intestinal mucosa, the mechanism may include inhibit NF-κB activation, down-regulate TNF-α mRNA, ICAM-1 mRNA expression.

Pancreatitis, acute necrotizing; Intestinal mucosa; NF-kappa B; Intestinal trefoil factor

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.05.012

浙江省醫藥衛生科學研究基金項目計劃(2006A088)

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化科

孟立娜，Email：mln6713@163.com