間隙連接蛋白43對胰腺癌細胞株BxPC3凋亡的作用及其機制研究

孫燕 姚瑋艷 張永平 喬敏敏 袁耀宗

·論著·

間隙連接蛋白43對胰腺癌細胞株BxPC3凋亡的作用及其機制研究

孫燕 姚瑋艷 張永平 喬敏敏 袁耀宗

目的研究間隙連接蛋白43(Cx43)在胰腺癌細胞凋亡中的作用，并探討其機制。方法采用脂質體2000法將pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、空質粒pcDNA3.0、siRNA-Cx43和對照siRNA-NC分別轉染BxPC3細胞。Western blotting檢測細胞Cx43蛋白表達、細胞色素C(Cyt C)含量；流式細胞儀檢測細胞凋亡、線粒體膜電位；熒光分光光度計檢測細胞Caspase-9和Caspase-3活性；染料傳遞法測定細胞間間隙連接(GJ)。結果Cx43轉染BxPC3細胞后， Cx43蛋白表達明顯上調，細胞凋亡從空質粒轉染組的(6.35±0.43)%增加到(14.29±1.24)%，經H2O2處理后，從(20.34±2.47)%增加到(31.27±2.56)%(Plt;0.05)，同時線粒體膜電位下降，Cyt C從線粒體釋放增多，Caspase蛋白酶活性增加；而siRNA43干擾細胞后，細胞凋亡從(7.42±0.47)%減少到(5.19±1.37)%，經H2O2處理后，從(19.43±1.71)%減少到(11.67±1.97)%(Plt;0.05)，線粒體膜電位去極化，Cyt C從線粒體釋放減少，Caspase酶活性下調。細胞間間隙連接指數在無GJ抑制劑β-GA情況下從對照組的14.52±0.57增加到pcDNA-Cx 43轉染組的23.05±3.84，在存在β-GA情況下從1.70±0.24增加到3.84±0.45(Plt;0.05)，但細胞凋亡率改變無顯著差異。結論Cx43可通過線粒體凋亡途徑促進BxPC3細胞凋亡，Cx43調節細胞凋亡存在間隙連接以外的機制。

胰腺腫瘤； 連接蛋白43； 間隙連接； 細胞凋亡

間隙連接(gap junction，GJ)由間隙連接蛋白(connexins，Cx)構成，相鄰細胞通過間隙連接所介導的細胞間間隙連接通訊(gap junction intercellular communication，GJIC)進行信息、能量和物質的交換[1],在維持組織內環境穩態中起重要作用[2]。目前已確定人類有21種連接蛋白[3]。研究發現，許多促癌物通過抑制Cx的途徑阻斷GJIC，使細胞增殖和凋亡的調控信號傳遞失控，而凋亡誘導劑可以增強Cx表達和GJIC功能，從而抑制腫瘤的生長和惡性轉化[4]。Cx43 作為最常見的一種連接蛋白，主要在心肌、平滑肌、胰腺等多種組織細胞表達。本實驗將插入Cx43的載體和針對Cx43的siRNA轉染胰腺癌細胞株BxPC3，觀察轉染細胞凋亡的變化，探討Cx43在細胞凋亡中的作用機制。

材料與方法

一、siRNA-Cx43、siRNA-NC和pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N載體的構建和細胞轉染

針對Cx43的siRNA(siRNA-Cx43)和陰性對照siRNA(siRNA-NC)合成及轉染BxPC3細胞由我們前期工作完成[5]。

按Homo sapiens Cx43基因序列使用primer5軟件設計Cx43引物。上游序列為5′-CCCAAGCTTGGGATGGGTGACTGGAGCGCC-3′，下游序列為5′-CGCGGATCCGCGCTAGATCTCCAGGTCATC-3′，上游序列引入HindⅢ酶切位點，下游序列引入BamHⅠ酶切位點，引物由上海生工公司合成。目的產物1173 bp。將PCR擴增的產物通過酶切，再連接至質粒pcDNA3.0。重組質粒pcDNA-Cx43常規轉化DH5a，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養基培養12 h，挑取單克隆搖菌，菌液經測序鑒定正確后大量制備。同時，根據Cx43第130～136位氨基酸殘基缺失突變可抑制GJ生成[6]的原理，設計Cx43突變體(Cx43N)的引物。上游為5′-GACATGCACTTGAAGCAGTACGGTATTGAAGAGCAT-3′，下游為5′-CTGTACGTGAACTTCGTCATGCCATAACTTCTCGTA-3′。以pcDNA-Cx43載體DNA為模板，根據基因定點突變試劑盒(碧云天公司)操作手冊進行PCR擴增。突變產物同樣插入pcDNA3.0，重組質粒pcDNA-Cx43N轉化大腸桿菌、測序鑒定和質粒大量制備。

人胰腺癌細胞株BxPC3購自美國ATCC，以3×105/孔接種于6孔板中，置無抗生素的培養基中培養至90%～95%融合時，按LipofectamineTM2000轉染試劑盒(Invitrogen公司)說明書，將pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N和空載體pcDNA3.0分別轉染BxPC3細胞。同樣，當細胞融合達30%～50%時，將siRNA-Cx43和siRNA-NC分別轉染BxPC3細胞。

二、轉染細胞Cx43蛋白表達的檢測

抽提各轉染組BxPC3細胞蛋白，常規Western blotting檢測Cx43蛋白表達。

三、細胞凋亡檢測

采用AnnexinⅤ/PI雙染法。將5個轉染組BxPC3細胞以1×105/孔接種于24孔板培養，每組設6個復孔。24 h后其中3個孔加凋亡誘導劑H2O2400 μmol/L，3個孔不加，繼續培養24 h。收集細胞，調整細胞濃度為1×106細胞/ml，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC(20 mg/L)和5μl PI(50 mg/L)，避光室溫反應15 min，流式細胞儀分析。以親本BxPC3細胞作為對照。

將pcDNA-Cx43 、pcDNA3.0轉染的BxPC3細胞在24孔板中培養，設6個復孔，每孔加入H2O2400 μmol/L。24 h后其中3個孔加50 μmol/L GJ抑制劑β-GA，3孔不加，繼續培養24 h，同法測細胞凋亡率。

四、線粒體膜電位檢測

按照線粒體膜電位檢測試劑盒Invitrogen公司說明書操作。設6個復孔的pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43和siRNA-NC轉染組細胞培養24 h后，其中3個孔加400 μmol/L H2O2，另3個孔不加，繼續培養24 h。收集各組細胞，調節細胞濃度為1×106細胞/ml，加入10 μl 200 μmol/L的JC-1，繼續培養15～30 min。以親本細胞為陽性對照，加入1 μl CCCP (線粒體電子傳遞鏈抑制劑)，37℃孵育5 min。各組細胞洗滌、重懸后用流式細胞儀分析。線粒體膜電位較高時，JC-1產生紅色熒光，線粒體膜電位較低時，JC-1產生綠色熒光，以綠光/紅光表示，比值高，膜電位低。

五、細胞色素C(Cyt C)釋放水平檢測

收集5個轉染組培養48 h的細胞，加細胞裂解液， 750 g離心10 min，取上清，再10 000 g離心15 min，取上清。Western blotting法檢測Cyt C的水平。

六、Caspase-9和Caspase-3酶活性檢測

按Caspase-9和Caspase-3酶活性檢測試劑盒(Biovision公司)說明書操作。收集培養48 h的5個轉染組細胞，PBS洗滌后加熒光底物37℃反應1 h，應用熒光分光光度計分析。以親本BxPC3測定值作為基數1，其他各組細胞以其的倍數表示。

七、細胞間間隙連接檢測

采用Kapoor等[7]提出的染料傳遞實驗方法進行。5個轉染細胞組設6個復孔培養24 h，其中3孔加50 μmol/L GJ抑制劑β-GA(Sigma公司)，3孔不加，繼續培養24 h，用可穿過間隙連接的發綠色熒光染色的探針Calcein-AM(Invitrogen公司)標記作為供體細胞。用發紅色熒光的細胞膜標記探針DiIC18處理的親本BxPC3細胞作為受體細胞。以供體∶受體1∶5的比例共孵育2 h，用流式細胞儀分析。如果供體和受體細胞間存在間隙連接，綠色的calcein-AM將從供體細胞轉移至紅色的受體細胞使受體細胞變成橙色。細胞間間隙連接指數=發生細胞間間隙連接細胞數/總的受體細胞數/供體細胞數。

八、統計學分析

結 果

一、細胞Cx43蛋白表達的變化

pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細胞Cx43表達增加，而siRNA-Cx43組細胞的Cx43表達較siRNA-NC組顯著減少(圖1)。

二、細胞凋亡率的變化

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組及親本BxPC3細胞未經H2O2處理的細胞凋亡率分別為(14.29±1.24)%、(12.53±2.32)%、(6.35±0.43)%、(5.19±1.37)%、(7.42±0.47)%和(4.57±0.51)%；經H2O2處理的細胞凋亡率分別為(31.27±2.56)%、(29.41±2.86)%、(20.34±2.47)%、(11.67±1.97)%、(19.43±1.17)%和(18.63±1.29)%。pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N組細胞凋亡率較pcDNA3.0組和親本組顯著增加(Plt;0.05)；siRNA-Cx43與siRNA-NC組及親本組的凋亡率在無H2O2處理時無顯著差異，而在H2O2處理后，表達顯著下調(Plt;0.05)。

圖1 Cx43蛋白表達

三、轉染細胞線粒體膜電位、Caspase-9，-3活性、Cyt C釋放的變化

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組未經H2O2處理時細胞線粒體的比值分別為0.27±0.04、0.22±0.05、0.12±0.02、0.15±0.01、0.19±0.04；H2O2處理后分別為0.58±0.05、0.53±0.02、0.35±0.07、0.21±0.07、0.40±0.05。pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細胞的線粒體膜電位較pcDNA3.0組顯著降低(Plt;0.05)，而siRNA-Cx43組細胞的膜電位較siRNA-NC組顯著增加(Plt;0.05)。

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組未經H2O2處理時細胞的Caspase-9及Caspase-3活性分別為2.43±0.58、2.07±0.47、1.19±0.17、1.32±0.19、1.72±0.27以及1.35±0.32、1.17±0.21、0.84±0.24、1.12±0.27、1.47±0.11；經H2O2處理后分別為6.85±0.67、6.34±0.57、3.82±0.54、2.43±0.28、4.52±0.74以及5.41±0.67、4.93±0.17、2.44±0.47、1.52±0.09、2.54±0.17。pcDNA-Cx43和pcDNA-Cx43N組細胞的Caspase-9、-3活性明顯高于pcDNA3.0組(Plt;0.05)，而siRNA-Cx43組細胞的Caspase-9、-3活性較siRNA-NC組顯著降低(Plt;0.05)。

pcDNA-Cx 43組細胞胞質CytC含量較其他幾組顯著增加；經H2O2處理后，pcDNA-Cx 43組胞質Cyt C含量依然明顯升高，而低表達Cx43細胞胞質CytC含量明顯減少(圖2)。

四、BxPC3細胞凋亡與GJIC的關系

pcDNA-Cx43、pcDNA-Cx43N、pcDNA3.0、siRNA-Cx43、siRNA-NC組細胞間間隙連接指數在無β-GA情況下分別為23.05±3.84、13.11±0.68、14.52±0.57、5.45±0.24、13.20±2.31；存在β-GA情況下分別為3.84±0.45、1.24±0.22、1.70±0.24、0.45±0.17、2.31±0.27。pcDNA-Cx 43組的細胞間間隙連接指數明顯高于其他各組，而siRNA-Cx43組明顯下降(Plt;0.05)。但pcDNA-Cx43組在存在或不存在β-GA情況下的細胞凋亡率分別為(25.82±1.47)%和(31.12±1.38)%，pcDNA3.0組分別為(17.12±0.98)%和(20.04±1.25)%，無顯著差異。提示GJIC與細胞凋亡無關聯。

圖2 各組細胞胞質中Cyt C蛋白含量

討 論

多種惡性腫瘤細胞普遍存在著Cx基因表達的嚴重受抑、缺失和間隙連接通訊功能的缺陷，而且腫瘤的惡性程度與Cx43基因的表達呈負相關。這一功能的恢復又表現出腫瘤生長控制和轉化表型抑制[8]。如用RNA干擾下調Cx43的表達可促進乳腺癌細胞的惡性表型[9];將Cx43 基因轉染至Cx43基因缺陷的HeLa細胞，Cx43表達上調，癌細胞的生長明顯緩慢、惡性表型受抑制[10]。本實驗也顯示了Cx43轉染的BxPC3細胞凋亡增加，而下調Cx43的表達，能減少細胞凋亡，表明Cx43對BxPC3的凋亡具有保護作用。

Cx43及其組成的GJ與細胞周期和細胞死亡、生長的調控有著密切的關系。這一調控作用可以通過GJ也可以不通過GJ 起作用[11]。本文應用GJ抑制劑β-GA抑制細胞間間隙連接通訊。結果轉染Cx43的BxPC3細胞的GJIC明顯減少，但是由H2O2引起的凋亡卻未明顯受到抑制，表明可能有細胞間間隙連接以外的機制參與Cx43調節凋亡的過程。

線粒體凋亡是內源性細胞凋亡的主要原因，線粒體膜電位下降通常是線粒體凋亡過程中最早發生的事件。Cyt C從線粒體內釋放至胞質是線粒體步入凋亡途徑的一個標志，線粒體釋放的CytC可以激活Caspase蛋白酶家族，從而引起細胞凋亡。Boengler等[12]報道，Cx43除可定位于細胞膜上，還可定位于線粒體膜上。本研究顯示，Cx43轉染BxPC3細胞后，細胞的線粒體膜電位下降，CytC從線粒體釋放增加，Caspase酶活性上調；而用siRNA下調BxPC3的Cx43表達，如果相反，提示Cx43對細胞凋亡的調節作用依賴線粒體凋亡信號轉導通路。但Cx43是通過何種信號分子作用從而激活線粒體凋亡途徑的的機制目前尚未清楚，有待進一步研究。

[1] Krysko DV,Mussche S,Leybaert L,et al.Gap junctional communication and connexin43 expression in relation to apoptotic cell death and survival of granulosa cells.J Histochem Cytochem,2004,52:1199-1207.

[2] Vinken M,Vanhaecke T,Papeleu P,et al.Connexins and their channels in cell growth and cell death.Cell Signal,2006,18:592-600.

[3] Evans WH,Martin PE.Gap junctions: structure and function (Review),Mol Membr Biol,2002,19:121-136.

[4] Ogawa T,Hayashi T,Tokunou M,et al.Suberoylanilide hydroxamic acid enhances gap junctional intercellular communication via acetylation of histone containing connexin 43 gene locus.Cancer Res,2005,65:9771-9778.

[5] 孫燕，袁耀宗，萬虹宇，等.下調間隙連接蛋白43表達促進人胰腺癌細胞的侵襲和血管形成.胃腸病學，2009，14:：39-43.

[6] Wang M,Martinez AD,Berthoud VM,et al.Connexin43 with a cytoplasmic loop deletion inhibits the function of several connexins.Biochem Biophys Res Commun,2005,333:1185-1193.

[7] Kapoor P,Saunders MM,Li Z,et al.Breast cancer metastatic potential: correlation with increased heterotypic gap junctional intercellular communication between breast cancer cells and osteoblastic cells.Int J Cancer,2004,111:693-697.

[8] Su YA,Bittner ML,Chen Y,et al.Identification of tumor-suppressor genes using human melanoma cell lines UACC903,UACC903(+6),and SRS3 by comparison of expression profiles.Mol Carcinog,2000,28:119-127.

[9] Shao Q,Wang H,McLachlan E,et al.Down-regulation of Cx43 by retroviral delivery of small interfering RNA promotes an aggressive breast cancer cell phenotype.Cancer Res,2005,65:2705-2711.

[10] Giaume C,Venance L.Intercellular calcium signaling and gap junctional communication in astrocytes.Glia,1998,24:50-64.

[11] Plotkin LI,Bellido T.Bisphosphonate-induced,hemichannel-mediated,anti-apoptosis through the Src/ERK pathway:a gap junction-independent action of connexin43,Cell Commun Adhes,2001,8:377-382.

[12] Boengler K,Dodoni G,Rodriguez-Sinovas A,et al.Connexin 43 in cardiomyocyte mitochondria and its increase by ischemic preconditioning.Cardiovasc Res,2005,67:234-244.

2008-09-10)

(本文編輯：屠振興)

Roleofconnexin43inapoptosisofpancreaticcancercelllineBxPC3

SUNYan,YAOWei-yan,ZHANGYong-ping,QIAOMin-min,YUANYao-zong.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

YUANYao-zong,Email:yyz28@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the role of connexin 43 (Cx43) in the apoptosis of pancreatic cancer cell line BxPC and its possible mechanism.MethodspcDNA-Cx43, pcDNA-Cx43N, pcDNA3.0, siRNA-Cx43 and siRNA-NC were transfected into BxPC3 cells via liposome method. Cx43 protein and Cytochrome C (Cyt C) concentration was determined by Western blot，and the apoptosis was analyzed by Annexin V/PI binding assay. The mitochondria apoptosis pathway involved in Cx43 associated apoptosis was examined which contains the depolarization of mitochondrial membrane potential (MMP); fluorospectrophotometer was used to measure the activities of caspase-3 and caspase-9. Gap junction intercellular communication(GJIC) was determined by dye-transfer method.ResultsCx43 protein expression increased after BxPC3 transfection, apoptosis rate increased from (6.35±0.43)% in empty vector transfection group to (14.29±1.24)%; after H2O2 treatment, apoptosis rate increased from (20.34±2.47)% to (31.27±2.56)% (Plt;0.05). Meanwhile, mitochondrial membrane potential was decreased, Cyt C was increasingly released from mitochondria, caspases activities were increased; after siRNA43 interference, apoptosis rate decreased from (7.42±0.47)% to (5.19±1.37)%, after H2O2treatment, apoptosis rate decreased from (19.43±1.71)% to (11.67±1.97)% (Plt;0.05). Decreased mitochondrial membrane potential and Cyt C

release were observed, caspases activities were decreased. GJIC of pcDNA-Cx 43 transfection group increased from 14.52±0.57 to 23.05±3.84, and it increased from 1.70±0.24 to 3.84±0.45 in the presence of β-GA (Plt;0.05). But the apoptosis rate was not significantly different.ConclusionsCx43 could promote BxPC3 apoptosis via mitochondrial apoptotic signal pathway, and the possible mechanism included signal pathway other than GJIC.

Pancreatic neoplasms; Connexin 43; Gap junction; Apoptosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.009

200025 上海，上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院消化科

袁耀宗，Email:yyz28@medmail.com.cn