三元復合因子Net對人胰腺癌細胞株BxPC3增殖的影響

諸琦 李百文 倪培華 曹海峽 黃佳 張愫

·論著·

三元復合因子Net對人胰腺癌細胞株BxPC3增殖的影響

諸琦 李百文 倪培華 曹海峽 黃佳 張愫

目的研究三元復合因子Net轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞株BxPC后的表達狀態(tài)及對原癌基因c-fos表達的影響。方法采用脂質(zhì)體2000將重組人pEGFP-Net質(zhì)粒和空質(zhì)粒pEGFP轉(zhuǎn)染人胰腺癌BxPC3細胞株，建立穩(wěn)定高表達Net的細胞系。應(yīng)用MTT、流式細胞儀等方法檢測胰腺癌細胞的增殖，應(yīng)用實時定量PCR和Western blotting檢測Net及c-fos mRNA和蛋白的表達。結(jié)果BxPC3細胞低表達Net，轉(zhuǎn)染pEGFP-Net后穩(wěn)定高表達Net，并抑制c-fos的表達。轉(zhuǎn)染pEGFP-Net的細胞生長緩慢，轉(zhuǎn)染后第3、5、7天的抑制率分別為38.8%、55.3%、56.9%，顯著高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的5.1%、12.4%、8.6%(Plt;0.05)；G0/G1期細胞占(61.8±5.7)%，顯著高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的(45.1±3.4)%。結(jié)論三元復合因子Net 能抑制人胰腺癌BxPC3細胞的增殖，其機制可能與抑制c-fos表達有關(guān)。

胰腺腫瘤； 三元配合物因子類； Net； c-fos； 細胞增殖

亞族中的一個成員，其特點是能夠與血清反應(yīng)因子(serum response factor, SRF)相互作用，共同結(jié)合于原癌基因c-fos啟動子上的血清反應(yīng)元件(serum response element, SRE)，三者共同形成復合體，從而調(diào)節(jié)c-fos基因的轉(zhuǎn)錄和表達[1]。現(xiàn)已明確,Net在正常狀態(tài)下能明顯抑制c-fos的轉(zhuǎn)錄[2]。從Net發(fā)現(xiàn)至今，結(jié)合胰腺癌的基礎(chǔ)或臨床應(yīng)用研究卻很少。本研究旨在對Net在胰腺癌細胞中的表達及對細胞增殖的影響做初步探討。

材料與方法

一、質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)GeneBank的人Net mRNA 序列設(shè)計引物，并在上下游引物的5′端分別加上XhoⅠ和 KpnⅠ的限制性內(nèi)切酶位點。正義5′-GATCTCGAGATGGAGAGTGCAATCACGCT-3′；反義5′-GAGGGTACC-GGATTTCTGAGAGTTTGAAGA-3′。應(yīng)用PCR技術(shù)擴增Net基因全長cDNA，并將其插入pEGFP-N1載體，構(gòu)建pEGFP-N1/Net質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測序鑒定。

二、細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定細胞株的建立

人胰腺癌細胞株BxPC3購自上海中科院細胞所，常規(guī)培養(yǎng)傳代。轉(zhuǎn)染前24 h將BxPC3細胞以3×105/孔鋪入6孔培養(yǎng)板。應(yīng)用脂質(zhì)體2000將pEGFP-N1/Net及pEGFP轉(zhuǎn)染BxPC3細胞，應(yīng)用G418篩選單個細胞克隆，在含200 μg/ml的G418培養(yǎng)液中維持生長和傳代。

三、實時定量PCR(real-time PCR)

應(yīng)用Trizol裂解抽提細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄至cDNA，實時PCR儀上行實時定量PCR(美國MJReseach公司)。Net引物，正義5′-ACGCTGCCAGTA-TTTCATCC-3′，反義5′-GACTAAGGCTGCTCCAGA-AAT-3′，片段387 bp；c-fos引物，正義5′-TGTCAACGCGCAGGACTTCT-3′，反義5′-CCTTCTCCTTCAGCAGGTTG-3′，片段443 bp；內(nèi)參β-actin引物，正義5′-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，反義5′- CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGA-GGG-3′，片段658 bp。每組3個復孔。在PCR任意循環(huán)中，當熒光強度值大于由儀器自帶軟件計算出的閾值(CT)時，樣本被認為是陽性，mRNA的表達量用2-△CT來表示(△CT=Net/c-fos CT值-β-actin CT值)，實驗重復3次，取均值。

四、蛋白印跡

細胞收集后加入裂解液(RIPA，上海申能博彩公司)提取蛋白，取30 g蛋白常規(guī)行Western blotting，最后ECL(Amersham Biosciences公司)顯影。

五、細胞生長檢測

將1×105/孔的親本細胞及2株轉(zhuǎn)染細胞鋪入6孔細胞培養(yǎng)板，設(shè)3個復孔。于培養(yǎng)后第 1、3、5、7 天收集細胞，并計數(shù)繪制生長曲線。

同時取上述3組對數(shù)生長期細胞，以每孔2×103個接種于96 孔板，設(shè)3個復孔。培養(yǎng)后第1、3、5、7天每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μl DMSO振蕩10 min，測定各孔A492值，取均值。生長增殖抑制率=(1-實驗組A492值/對照組A492值)×100%。

六、細胞周期檢測

收集各組對數(shù)生長期細胞，PBS洗滌后加預冷的70%乙醇4℃固定過夜。棄乙醇后PBS重懸細胞，加1 ml碘化丙啶(PI)染液，避光4℃孵育20 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

七、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、細胞Net 和 c-fos mRNA及蛋白表達的變化

pEGFP-N1/Net轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、親本BxPC3組的Net mRNA表達量分別為34.73±0.46、9.45±0.23、9.43±0.30，pEGFP-N1/Net轉(zhuǎn)染組明顯高于其他兩組(Plt;0.01)；3組c-fos mRNA表達量分別為10.39±0.60、31.60±1.20、33.22±0.95，pEGFP-N1/Net轉(zhuǎn)染組明顯低于其他兩組(Plt;0.01)。各組細胞Net和c-fos蛋白表達的變化趨勢與mRNA表達趨勢相一致 (圖1)。

圖1 Net及c-fos蛋白在各組中的表達變化

二、各組細胞生長和增殖的改變

pEGFP-N1/Net轉(zhuǎn)染組細胞生長明顯慢于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和親本BxPC3組(圖2，Plt;0.05)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和親本BxPC3組間無明顯差異。

pEGFP-N1/Net轉(zhuǎn)染組細胞培養(yǎng)后第1、3、5、7天的增殖抑制率分別為1.0%、38.8%、55.3%、56.9%；空載體轉(zhuǎn)染組為0.8%、5.1%、12.4%、8.6%，從第3天起差異顯著(圖3，Plt;0.01)。

三、各組細胞的周期變化

pEGFP-N1/Net組G0/G1期細胞占(61.8±5.7)%，S期細胞占(27.4±4.9)%；親本BxPC3組分別為(46.9±4.3)%和(47.3±7.2)%；空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別為(45.1±3.4)%和(46.8±5.6)%。Net轉(zhuǎn)染后使細胞周期明顯阻滯在G0/G1期(Plt;0.01)。其他兩組間無明顯差異。

圖2 Net過表達對胰腺癌細胞生長曲線的影響

圖3 Net過表達對胰腺癌細胞增殖的影響

討 論

原癌基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控可能在癌基因啟動過程中起到了“開關(guān)”的作用，因此研究癌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可能為尋找治療腫瘤的新靶點提供希望。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子TCFs家族有3個成員：Net、ELK-1和Sap-1[3-4]。雖然它們具有相似的結(jié)構(gòu)域，但在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上的作用不同。生理狀態(tài)下，Net對靶基因c-fos的轉(zhuǎn)錄起明顯抑制作用，但當外界刺激通過Ras-絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路后，使Net失去有效的抑制功能，原癌基因c-fos則迅速啟動轉(zhuǎn)錄，促進細胞無限制增殖。

c-fos是與胰腺癌高度相關(guān)的一個原癌基因。Sakorafas等[5]報道，胰腺癌c-fos基因過度表達；Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn)，c-fos過度表達與胰腺癌的進展密切相關(guān)。本實驗結(jié)果也顯示BxPC3細胞的c-fos mRNA 和蛋白均呈明顯高表達。業(yè)已證實，c-fos的短時誘導轉(zhuǎn)錄主要受SIE、SRE、CRE以及FAP-1等4個啟動元件調(diào)節(jié)[7]。但大多數(shù)的信號是通過調(diào)控SRE啟動c-fos轉(zhuǎn)錄[8]。TCF、SRF的磷酸化可激活SRE，但持續(xù)激活SRE更主要的原因可能是SRE抑制因子的缺失[9]。Net作為抑制因子，它的缺失或改變可能是SRE持續(xù)激活的主要原因。本實驗結(jié)果顯示，BxPC3細胞低表達Net，而高表達c-fos。當我們把外源性Net表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到該細胞后，Net高表達，而c-fos的表達明顯減少，提示Net過表達確實存在對c-fos表達的抑制。同時，細胞的生長和增殖明顯被抑制，細胞周期大部分停滯于 G0/G1期，表明外源性轉(zhuǎn)染導致的Net過表達阻滯胰腺癌的細胞周期進程及細胞增殖可能與其抑制原癌基因c-fos的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

[1] Buchwalter G,Gross C,Wasylyk B,et al.Ets ternary complex transcrip- tion factors.Gene,2004,324:1-14.

[2] Hollenhorst PC, Jones DA, Graves BJ. Expression profiles frame the promoter specificity dilemma of the ETS family of transcription factors. Nucleic Acids Res, 2004, 32: 5693 - 5702.

[3] Iwata A, Miura S, Kanazawa I, et al. Alpha-Synuclein forms a complex with transcription factor Elk-1. J Neurochem, 2001, 77: 239-252.

[4] Stinson J, Inoue T, Yates P, et al. Regulation of TCF ETS-domain transcription factors by helix-loop- helix motifs. Nucleic Acids Res, 2003, 31: 4717-4728.

[5] Sakorafas GH, Tsiotou AG, Tsiotos GG. et al. Molecular biology of pancreatic cancer; oncogenes, tumour suppressor genes, growth factors, and their receptors from a clinical perspective. Cancer Treat Rev, 2000, 26: 29-52.

[6] Lee CS, Charalambous D. Immunohistochemical localization of the c-fos oncoprotein in pancreatic cancers. Zentral Pathol, 1994, 140: 271-275.

[7] Gonzales M, Bowden GT. Ultraviolet B (UVB) induction of the c-fos promoter is mediated by phospho-cAMP response element binding protein (CREB) binding to CRE and c-fos activator protein 1 site (FAP1) cis elements. Gene, 2002, 293: 169-179.

[8] Brellier F, Marionnet C, Chevallier-Lagente O, et al. Ultraviolet irradiation represses PATCHED gene transcription in human epidermal keratinocytes through an activator protein-1- Dependent Process. Cancer Res, 2004, 64: 2699-2704.

[9] Van Riggelen J, Buchwalter G, Soto U, et al. Loss of net as repressor leads to constitutive increased c-fos transcription in cervical cancer cells. J Biol Chem, 2005, 280: 3286-3294.

2009-02-23)

(本文編輯：呂芳萍)

TheeffectofternarycomplexfactorNetontheproliferationofhumanpancreaticcarcinomacelllineBxPC3

ZHUQi,LIBai-wen,NIPei-hua,CAOHai-xia,HUANGJia,ZHANGSu.

DepartmentofGastroenterology,RuijinHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

ZHUQi,Email:zhuqi@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of the ternary complex factor Net in human pancreatic carcinoma cell line BxPC3 and its effect on cell proliferation and the expression of c-fos.MethodspEGFP-Net prokaryotic expression plasmid and empty vector pEGFP were transfed into BxPC3 cells by using lipofectamine 2000, then monoclonal cell which stably expressing Net was established. Human pancreatic carcinoma cells proliferation was detected by MTT and flow cytometry. The mRNA and protein expression of Net and c-fos in BxPC3 cells were detected by real-time PCR and Western blot.ResultsNet was low expressed in BxPC3 cells. After pEGFP-Net transfection, Net was stably expressed and the expression of c-fos was inhibited, cell proliferation was also inhibited after pEGFP-Net transfection, the inhibitory rates at the 3rd, 5th, 7th day was 38.81%, 55.34% and 56.92% respectively，which were significantly higher than those in the empty vector group (5.09%, 12.42%, 8.6%,Plt;0.05). G0/G1phase cell was (61.79±5.67)%, which were significantly higher than (45.14±3.37)% in the empty vector group (Plt;0.05).ConclusionsThe ternary complex factor Net could inhibit pancreatic carcinoma cell line BxPC3 proliferation. Its mechanism was possibly repressing expression of oncogene c-fos.

Pancreatic neoplasms; Ternary complex factors； Net； c-fos； Cell proliferation

Net基因是E-twenty-six(Ets)結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族三元復合因子(ternary complex factors, TCFs)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.008

上海市教委科研資助項目(05BZ40)

200025 上海，上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院消化科(諸琦、李百文、曹海俠、黃佳、張愫)，檢驗系(倪培華)

諸琦，Email:zhuqi@medmail.com.cn