p15INK4B基因對人胰腺癌細胞系BxPC3增殖的影響

張學彥 劉志強 景德懷 關景明 劉偉

·論著·

p15INK4B基因對人胰腺癌細胞系BxPC3增殖的影響

張學彥 劉志強 景德懷 關景明 劉偉

目的探討p15INK4B(p15)基因轉染對人胰腺癌細胞系BxPC3細胞增殖的影響。方法采用脂質體將pCDNA3.1(+)-p15質粒及陰性對照pCDNA3.1(+)-neo質粒轉染BxPC3細胞，以親本細胞作為對照組。應用RT-PCR檢測細胞p15 mRNA表達；Western blotting檢測細胞p15蛋白表達；MTT法檢測細胞增殖；透射電鏡觀察細胞超微結構變化；流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率。結果p15轉染組細胞恢復p15 mRNA和蛋白表達。培養第2天生長被抑制，至第7天，生長抑制率達47.9%。G0/G1期細胞占(61.56±3.96)%，顯著高于空質粒轉染組的(47.44±6.35)%和對照組的(49.22±7.23)%(Plt;0.05)。出現明顯的G1凋亡峰，細胞凋亡率為(5.27±1.04)%，顯著高于空質粒轉染組的(0.11±0.06)%和對照組的(0.09±0.07)%(Plt;0.05)。透射電鏡觀察到p15轉染組發生細胞凋亡。結論體外p15基因轉染可以抑制人胰腺癌細胞系BxPC3細胞增殖，并能誘導其凋亡。

胰腺腫瘤； 轉染； 周期素依賴激酶抑制劑p15

p15INK4B(簡稱p15)是近年來發現的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors, CKI)家族中的一個新成員,在胰腺癌發生過程中經常失活[1]。為探討恢復p15表達能否抑制人胰腺癌細胞的增殖，本研究將p15轉染到人胰腺癌細胞系BxPC3中，觀察其對胰腺癌細胞生長的影響。

材料和方法

一、材料

真核表達質粒pCMV5-p15由北京師范大學生命科學學院-教育部細胞增殖與調控重點實驗室柳惠圖教授惠贈，我實驗室先期將其亞克隆至有真核篩選標志新霉素抗性基因(neo)的質粒pCDNA3.1(+)上，稱為pCDNA3.1(+)-p15質粒[2]。BxPC3細胞株購自中國科學院上海細胞所。Trizol試劑盒是Gibco公司產品，Taq酶為上海生工公司產品，逆轉錄試劑盒、限制性內切酶、轉染級質粒中提試劑盒是Promega公司產品。p15小鼠抗人單抗是Neo Markers公司產品，辣根酶標山羊抗小鼠IgG為北京中杉金橋公司產品。 actin beta(ACTB)抗體和Western blotting發光試劑是Santa Cruz公司產品。脂質體Lipofectamine2000購于Invitrogen公司。引物由上海生工公司合成。上海生工公司進行質粒測序。

二、p15質粒轉染BxPC3

人胰腺癌BxPC3細胞系在37℃、5% CO2飽和濕度條件下，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養傳代，收集對數生長期細胞。

提取pCDNA3.1(+)-p15，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，PCR擴增片段鑒定正確后用pCDNA3.1(+)載體的測序引物T7測序驗證明確后擴增大腸桿菌，并抽提質粒。采用Lipofectamine2000脂質體將pCDNA3.1(+)-p15質粒轉染BxPC3細胞，為p15轉染組；用空質粒pCDNA3.1(+)-neo轉染BxPC3細胞，為陰性對照組；未轉染的BxPC3細胞為空白對照組。每組3個樣本。

三、細胞p15 mRNA和蛋白的檢測

p15 mRNA表達采用RT-PCR檢測。采用Trizol提取細胞總RNA。逆轉錄cDNA反應體系20 μl,含隨機引物0.5 μg、逆轉錄酶200 U、RNA 1.0 μg、dNTP 0.5 mmol/L、RNasin 20 U，37℃ 60 min，95℃ 5 min。

PCR反應體系25 μl,含Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.5 mmol/L、cDNA 2 μl、TaqDNA合成酶2 U、上下游引物各0.4 μmol/L。p15 上游引物5′-CCAGAA-GCAATCCAGGCGCG-3′，下游引物5′-CGTTGG-CAGCCTTCATCG-3′，產物753 bp，退火58℃；內參β-actin上游引物5′-CCCAGCACAATGAAGATCAAG-ATCAT-3′，下游引物5′-ATCTGCTGGAAGGTGGAC-AGCGA-3′，產物100 bp，反應35個循環。產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳，照相。

p15蛋白表達采用常規Western blotting檢測，以表達p15蛋白的Hela細胞為陽性對照。

四、細胞增殖檢測

采用MTT法。取對數生長期細胞，按3×103個細胞/孔接種96孔板，每孔加5 g/L MTT溶液20 μl，37℃孵育4 h，每孔加180 μl二甲基亞砜，振蕩10 min， 測定A490值，每隔1天測定一次，連續測定7 d，繪制細胞生長曲線。

五、細胞凋亡檢測

采用流式細胞儀檢測。取各組1×106個細胞，加入70%冷乙醇4℃固定24 h，用50 mg/L RNase 37℃處理30 min，加100 mg/L碘化丙啶避光染色30 min,上流式細胞儀測定。

六、細胞超微結構觀察

取各組1×106個細胞，1500 r/min離心10 min，加入3%戊二醛固定一周，送透射電鏡檢測。

七、統計學處理

結 果

一、BxPC3細胞p15 mRNA和蛋白的表達

親本代BxPC3細胞不表達p15 mRNA和蛋白。p15轉染組細胞表達p15mRNA，擴增出753 bp 的目的條帶(圖1)；表達p15蛋白，存在分子質量為15 000的目的條帶(圖2)。空質粒轉染陰性對照組和未轉染空白對照組均不表達p15 mRNA和蛋白。

二、細胞增殖的變化

空質粒轉染組和未轉染組細胞增殖基本一致。而轉染p15基因后BxPC3細胞增殖從第2天起開始被抑制，生長抑制率為17.4%，隨時間延長抑制率逐漸升高，第7天時達47.9%(圖3)。

1．Marker KL2000；2．BxPC3細胞；3．p15轉染細胞

1．Marker；2．陽性對照Hela；3．p15轉染組；4．空質粒轉染組；5．BxPC組

圖2各組細胞p15蛋白檢測

三、細胞周期變化

圖3 各組BxPC3細胞生長曲線

p15轉染組的G0/G1期細胞占(61.56±3.96)%，顯著高于空質粒轉染組的(47.44±6.35)%和未轉染組的(49.22±7.23)% (Plt;0.05)；S期細胞占(21.75±1.99)%，顯著低于空質粒轉染組的(35.25±3.97)%和未轉染組的(36.01±1.54)% (Plt;0.01)。p15轉染組出現明顯的G1凋亡峰，細胞凋亡率為(5.27±1.04)%，顯著高于空質粒轉染組的(0.11±0.06)%和未轉染組的(0.09±0.07)%(圖4，Plt;0.05)。

四、細胞超微結構的改變

空質粒轉染組細胞生長狀態較好，未見凋亡形態學改變，核漿比例大，圓形核仁多，細胞表面絨毛密集排列，雙層核膜結構清晰，胞質內有豐富的游離核蛋白體。p15轉染組可見部分細胞發生凋亡，細胞體積變小，表面絨毛消失，核固縮，染色質形成高密度斑塊，胞質內出現大量脂肪滴顆粒，部分線粒體出現髓樣變，游離核糖體減少(圖5)。

1.BxPC3組；2.空質粒轉染組；3. p15轉染組

1.BxPC3組；2.空質粒轉染組；3. p15轉染組

討 論

p15是近年來發現的一類CKI分子，定位于9號染色體9p21區，這一位點易發生缺失、突變和甲基化，從而導致惡性腫瘤發生。p15被認為是除了p53、Rb之外的CKI類重要抑癌基因[3]。p15的抑癌機制與細胞周期調控密切相關，它能直接作用于CyckinD1/CDK4復合物中的CyclinD1，從而影響CDK4激酶的活性，導致pRb磷酸化水平下降，使細胞被阻滯在G1期。其次，癌基因c-myc的產物Myc與Max結合形成一個轉錄因子，具有促進細胞轉化、誘導腫瘤發生的作用，而p15高表達能引起c-Myc蛋白表達水平下降。第三，原癌基因c-fos參與形成轉錄因子AP-1，AP-1能激活生長類蛋白基因的轉錄,對細胞周期起正調作用[4]，而p15高表達可引起c-fos蛋白表達水平的下降。此外，p15失活在惡變中所起的重要作用可能與其引起Cyckin-Rb通路失控和控制細胞增殖的作用喪失直接相關。

胰腺癌時Smad4失活，p15是Smad4的關鍵下游效應基因[5]，Smad4和p15功能喪失就導致了TGF-β喪失誘導CDK抑制因子的作用[6]。Hitomi等[7]認為，p15是組蛋白去乙酰基(Histone deacetylase,HDAC)抑制物的重要分子靶點，而HDAC抑制物能將人腫瘤細胞阻滯于G1期，并能激活細胞周期依賴激酶抑制物p21WAF1。

p15基因在胰腺癌中有較高頻率的失活，失活的主要機制包括純合缺失及甲基化[1,8]，p15基因有可能成為胰腺癌基因治療的新目的基因。文獻報道[2-4，9-11]，p15基因轉染食管癌、黑色素瘤細胞、肝癌、膽管癌及神經膠質瘤細胞均能抑制細胞生長,有關p15轉染對胰腺癌細胞增殖是否有抑制作用尚無研究報道。本實驗結果顯示，BxPC3細胞在轉染p15基因而恢復p15蛋白高表達后，其增殖明顯受到抑制，細胞被阻滯在G1/S期，出現凋亡特征性的亞G1峰，提示p15轉染對胰腺癌有明顯的生長抑制作用，并能誘導細胞凋亡，為胰腺癌的基因治療提供了一種新途徑。p15轉染的優點是其片段長度小，克隆和轉染操作比較方便，可能是具有應用前景的基因治療的較好的靶基因。

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2009-02-18)

(本文編輯：呂芳萍)

Inhibitoryeffectofp15INK4BgeneonproliferationofhumanpancreaticcancercelllineBxPC

ZHANGXue-yan,LIUZhi-qiang,JINGDe-huai,GUANJing-ming,LIUWei.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,HarbinMedicalUniversity,Harbin150086,China

ZHANGXue-yan,Email:zxycxw@sina.com

ObjectiveTo investigate the effect of p15INK4B(p15) gene transfection on the proliferation of pancreatic cancer cell line BxPC3.MethodsIn p15 transfection group, pCDNA3.1(+) p15 was transfected into BxPC3 cell by the vector of Lipofectamine2000. In empty plasmid transfection group, pCDNA3.1(+) neo was transfected into BxPC3 cell with the same method as a blank control group. In non-transfection group, the BxPC3 cell was not transfected as a negative control group. The p15 mRNA expressions were assayed by RT-PCR, and p15 protein expressions were assayed by Western blot. The proliferation was determined by MTT assay, ultra-structure changes were measured by transmission electron microscope. Cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry.ResultsIn the pCDNA3.1(+) p15 transfection group, the expression of p15 mRNA and protein were resumed. Since the 2nd day of culture, the growth of pCDNA3.1(+) p15 transfection group was inhibited, till the 7th day, the inhibitory rate was 47.9%, G0/G1phase cell accounted for (61.56±3.96)% of all the cells, which was significantly higher than (47.44±6.35)% of the black control groups and (49.22±7.23)% of the negative control group(Plt;0.05). G1apoptosis peak occurred and the apoptosis rate was (5.27±1.04)% in pCDNA3.1(+) p15 transfection group, which was significantly higher than (0.11±0.06)% of the black control groups and (0.09±0.07)% of the negative control group (Plt;0.05). Apoptosis was also observed by transmission electron microscope in the pCDNA3.1(+)-p15 transfection group cells.ConclusionsAfter p15 gene transfection, BxPC3 cell proliferation could be significantly inhibited and apoptosis could be induced.

Pancreatic neoplasms; Transfection； Cyclin-dependent kinase inhibitor p15

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.007

黑龍江省科技計劃攻關基金重點項目(GB05C401-09),黑龍江省教育廳科學技術研究項目(11521191),黑龍江省衛生廳科研項目(2007-304)

150086 哈爾濱，哈爾濱醫科大學附屬二院消化科

張學彥，Email:zxycxw@sina.com