新生淋巴管在判斷胰腺癌預后的獨立胰腺導管腺癌周圍神經(jīng)叢微轉(zhuǎn)移過程中的機制研究

程鵬 金鋼 胡先貴 陳穎 劉瑞 張怡杰 邵成浩 周穎奇

·論著·

新生淋巴管在判斷胰腺癌預后的獨立胰腺導管腺癌周圍神經(jīng)叢微轉(zhuǎn)移過程中的機制研究

程鵬 金鋼 胡先貴 陳穎 劉瑞 張怡杰 邵成浩 周穎奇

目的研究新生淋巴管在胰腺導管腺癌周圍神經(jīng)叢微轉(zhuǎn)移過程中的作用與機制。方法收集2005年9月至2006年10月長海醫(yī)院行胰腺癌擴大根治術(shù)的30例胰腺導管腺癌患者的臨床資料，術(shù)中采集胰腺腫瘤、癌旁、膽管下段、胰尾、腸系膜上動脈(SMA)旁組織(含胰周神經(jīng)叢)以及區(qū)域淋巴結(jié)標本。常規(guī)病理檢查，采用雙重免疫組化方法檢測毛細淋巴管，計算淋巴管密度(LVD)。結(jié)果胰內(nèi)和(或)胰周神經(jīng)叢浸潤25例(83.3%)，其中胰內(nèi)合并胰周神經(jīng)叢浸潤20例，單純胰內(nèi)神經(jīng)浸潤5例，無單純胰周神經(jīng)叢浸潤病例。神經(jīng)浸潤與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤部位無明顯相關(guān)性(Pgt;0.05)，但與JPS臨床分期相關(guān)(Plt;0.05)。癌組織內(nèi)的平均LVD為每視野(4.2±3.4)個，顯著少于癌旁的(11.3±6.9)個及正常胰腺組織的(10.8±4.4)個(Plt;0.01) ，正常胰腺組織與癌旁組織平均LVD值差異無統(tǒng)計學意義。18例胰腺癌患者在非癌組織清晰可見腫瘤浸潤淋巴管，而且胰周神經(jīng)叢浸潤與淋巴管腫瘤浸潤間亦有明顯相關(guān)性(Plt;0.05)。結(jié)論胰腺導管腺癌周圍神經(jīng)叢浸潤的發(fā)生率較高，神經(jīng)浸潤與JPS臨床分期、淋巴管浸潤有明顯相關(guān)性，提示胰腺導管腺癌存在通過新生淋巴管途徑擴散轉(zhuǎn)移的可能性。

胰腺腫瘤； 腫瘤轉(zhuǎn)移； 淋巴管； D2-40； 微轉(zhuǎn)移

材料和方法

一、臨床資料

收集第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院普外科2005年9月至2006年10月行胰腺癌擴大根治術(shù)的經(jīng)病理檢查證實的30例胰腺導管腺癌患者，其中男19例，女11例，年齡35～76歲。22例腫瘤位于胰頭及鉤突部，8例位于胰頸、體尾部。30例經(jīng)影像學檢查及術(shù)中檢查均明確無遠處臟器轉(zhuǎn)移。22例(73.3%)行胰頭十二指腸切除術(shù)，8例(26.7%)行胰體尾切除術(shù)。30例均行淋巴結(jié)廓清(D1或D2)。腫瘤直徑2.0～5.5 cm；中分化24例，低分化6例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例(56.7%)；根據(jù)日本2002年第5版胰腺癌治療規(guī)范(JPS)的臨床分期標準，Ⅱ期4例(13.3%)，Ⅲ期 5例(16.7%)，Ⅳ期21例(70.0%)。

二、標本采集

將術(shù)中采集的各例標本分成腫瘤組、癌旁組(距腫瘤組織 ≤1.2 mm且未被腫瘤組織包圍)、周圍正常胰腺組(距腫瘤組織 gt;1.2 mm )；另有SMA旁組織(含神經(jīng)叢)、區(qū)域淋巴結(jié)，大小為2.0 cm×1.5 cm×0.3 cm。所有標本固定、包埋、連續(xù)切片，間隔取1套行HE染色，另1套行免疫組化染色。

三、D2-40和CK19雙重免疫組化染色

按照雙染試劑盒(Polylink DS kit，中杉金橋生物技術(shù)公司)說明書操作。鼠抗人D2-40單克隆抗體(DAKO，USA)及兔抗人CK19單克隆抗體(Epitomics，USA)均1∶100稀釋。以PBS代替一抗作為陰性對照，同一切片的非染色部位作為陽性對照。CK19和D2-40雙重免疫組化陽性表現(xiàn)為紅色和棕黃色顆粒。

淋巴管密度(LVD)測定：淋巴管內(nèi)皮細胞胞膜和胞質(zhì)的D2-40陽性染色呈棕黃色顆粒狀。標記陽性淋巴管一般呈擴張狀，形態(tài)不規(guī)則，壁薄，管壁無平滑肌，管腔內(nèi)偶見淋巴細胞，也可見由幾個內(nèi)皮細胞構(gòu)成的細胞簇，甚至僅見單個內(nèi)皮細胞。40倍光鏡下確定D2-40染色陽性最集中的區(qū)域，然后在200倍視野下計數(shù)3個視野的染色陽性淋巴管數(shù),取均值,為各個組織的LVD。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析系統(tǒng)。神經(jīng)浸潤與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及胰周神經(jīng)叢浸潤與淋巴管腫瘤浸潤的相關(guān)性采用Fisher確切概率法。LVD值符合正態(tài)分布，采用配對t檢驗分析。Plt;0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、胰腺癌神經(jīng)浸潤及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HE染色可見導管腺癌細胞浸潤神經(jīng)束膜，有的神經(jīng)纖維束被腫瘤細胞包繞形成完整的一層癌性上皮(圖1)，但難以辨別毛細淋巴管與毛細血管。

圖1 胰周神經(jīng)叢中癌細胞包繞胰周神經(jīng)束( HE ×100)

胰內(nèi)和(或)胰周神經(jīng)叢浸潤25例(83.3%)，其中胰內(nèi)合并胰周神經(jīng)叢浸潤20例(66.7%)，單純胰內(nèi)神經(jīng)浸潤5例(16.7%)。胰內(nèi)與胰周神經(jīng)叢浸潤相關(guān)(Plt;0.05)。

神經(jīng)浸潤與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤部位之間均無相關(guān)性(P值均gt;0.05)，但與JPS臨床分期相關(guān)(Plt;0.05，表1)。

表1胰腺導管腺癌神經(jīng)浸潤及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

臨床病理參數(shù)例數(shù)神經(jīng)浸潤(例)陽性陰性P值年齡(歲)≥5022184lt;50871gt;0．05性別男19154女11101gt;0．05腫瘤部位胰頭22193胰頸體尾862gt;0．05腫瘤大小(cm)≥4．013121lt;417134gt;0．05JPS分期Ⅰ、Ⅱ期413Ⅲ、Ⅳ期26242lt;0．05淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性17143陰性13112gt;0．05

二、胰腺組織的LVD

胰腺癌、癌旁及正常胰腺組織內(nèi)均有淋巴管分布，表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞D2-40染色陽性的微小管道結(jié)構(gòu)，由單層內(nèi)皮細胞構(gòu)成，不規(guī)則開放，管壁較薄，管腔內(nèi)無紅細胞(圖2)，大多分布在間質(zhì)組織中。而有紅細胞填充的厚壁小血管對D2-40抗體呈陰性反應。胰腺癌內(nèi)及癌旁淋巴管分布不均勻，一些淋巴管受腫瘤細胞壓迫萎陷，直徑及管腔均小于正常胰腺組織內(nèi)淋巴管。正常胰腺組織內(nèi)淋巴管多與間質(zhì)內(nèi)小胰管、血管及神經(jīng)束伴行。

圖2 癌旁區(qū)的淋巴管(免疫組化 ×40)

正常胰腺組織內(nèi)平均LVD值為(10.8±4.4)個,癌旁組織為(11.3±6.9)個,癌組織為(4.2±3.4)個，其中5例(16.7%)胰腺癌組織內(nèi)為陰性。癌組織的LVD值顯著少于癌旁及正常胰腺組織(Plt;0.01)，而正常胰腺組織與癌旁組織間無顯著差異(Pgt;0.05)。

三、胰周神經(jīng)叢浸潤與淋巴管微轉(zhuǎn)移的關(guān)系

18例(60.0%)胰腺癌患者在非癌組織中的淋巴管內(nèi)發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞浸潤。即在D2-40染成棕黃色的淋巴管內(nèi)有CK19染成紅色的胰腺癌細胞(圖3)。20例胰周神經(jīng)叢浸潤者中淋巴管腫瘤浸潤16例，10例無胰周神經(jīng)叢浸潤者中淋巴管腫瘤浸潤2例，兩者明顯相關(guān)(Plt;0.05)。

圖3 癌旁區(qū)域淋巴管被腫瘤細胞浸潤(免疫組化 ×100)

討 論

近年來對胰腺癌生物學行為的研究表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與神經(jīng)浸潤是影響胰腺癌預后最重要的兩個因素[5]。目前胰腺癌周圍神經(jīng)浸潤研究的臨床意義在于提高無遠隔臟器轉(zhuǎn)移的胰腺癌病例的手術(shù)切除率，減少術(shù)后復發(fā)，以期針對胰腺癌嗜神經(jīng)生長的生物學特征，通過適當擴大區(qū)域淋巴結(jié)及周圍神經(jīng)叢清掃范圍，使遠期生存率得到提高，達到徹底治愈可切除病例的目的。

以往有學者提出，是否由于淋巴路途徑導致神經(jīng)浸潤的發(fā)生。由于缺乏淋巴管特異性標記物，以往只能通過淋巴管注射染料或電子顯微鏡技術(shù)對淋巴管進行研究，但這存在著較大的局限性。本實驗HE染色結(jié)果也說明常規(guī)染色方法難以對淋巴管形態(tài)學進行研究。因而胰腺癌組織內(nèi)淋巴管分布一直是一個研究空白[6]。D2-40單克隆抗體與淋巴管上皮內(nèi)一種唾液酸糖蛋白結(jié)合，已經(jīng)被證實能夠特異性識別頭頸部鱗癌、乳腺癌及Kaposi肉瘤組織內(nèi)淋巴管[7]。故本實驗也采用該抗體。結(jié)果顯示，胰腺導管腺癌組織中淋巴管分布存在一定的規(guī)律性，癌組織內(nèi)的LVD顯著低于癌旁及正常胰腺組織(Plt;0.01)。其原因可能為腫瘤細胞生長對周圍淋巴管產(chǎn)生壓力或直接侵入管腔，致其萎陷甚至潰破。此外，本組結(jié)果顯示神經(jīng)浸潤與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均無相關(guān)性。但與JPS臨床分期相關(guān)。

我們曾報道在腸系膜上動脈周圍神經(jīng)叢內(nèi)有網(wǎng)狀淋巴管分布，腫瘤細胞有可能通過毛細淋巴管網(wǎng)浸潤周圍神經(jīng)叢[8]。本實驗在非癌組織中的淋巴管內(nèi)也發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞浸潤，且胰周神經(jīng)叢浸潤與淋巴管腫瘤浸潤之間有明顯相關(guān)性(Plt;0.05)。表明胰腺癌能夠誘導淋巴管生成，并可能通過該新生淋巴管通路浸潤胰周神經(jīng)叢。

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2008-11-21)

(本文編輯：屠振興)

Lymphangiogenesisintheperineuralmicrometastasisofpancreaticadenocarcinoma

CHENGPeng,JINGang,HUXian-gui,CHENYing,LIURui,ZHANGYi-jie,SHAOCheng-hao,ZHOUYing-qi.

DepartmentofGeneralSurgery,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

JINGang,Email:jingang@sh163.com

ObjectivesTo investigate the role of lymphangiogenesis in the perineural micrometastasis of pancreatic adenocarcinoma.MethodsThe clinical data of 30 pancreatic adenocarcinoma patients who were admitted from Sep. 2005 to Oct. 2006 for extended radical surgery were collected. The samples including pancreatic cancer, adjacent tissue, lower bile duct, pancreatic tail, the structure surrounding the SMA (peripancreatic nerve plexus) and lymph nodes were collected during operation. They were subjected to conventional pathological examination. The lymphatic capillaries weredetected by double immunohistochemical staining and the lymphatic vessel density (LVD) was measured.ResultsIntra-pancreatic and/or peri-pancreatic neural invasion was observed in 25 patients (83.3%), of which 20 were found to have both the peri-pancreatic and intra-pancreatic neural invasion. The other 5 only had the intrapancreatic neural fiber invasion and there was no single patient with peri-pancreatic neural fiber invasion only. Peri-neural invasion was not significantly associated with patients′ age, gender, lymph node metastasis, tumor size and the location (Pgt;0.05), but was obviously associated with JPS clinical staging (Plt;0.05). The mean intratumoral LVD was (4.2±3.4) per field, which was significantly lower than (11.3±6.9) per field of adjacent tissue and (10.8±4.4)per field of normal pancreatic tissue(Plt;0.01). The mean intratumoral LVD between adjacenttissue and normal pancreatic tissue was not statistically different. Lymphatic vessel invasion was observed in non-malignant tissues in 18 patients, and there was a distribution correlation between lymphatic vessel invasion and extra-pancreatic neural plexus invasion (Plt;0.05).ConclusionsThe incidence of peri-neural invasion was high, peri-neural invasion was associated with JPS clinical staging and lymphatic vessel invasion, which suggested the possibility of the cancer spreading by peritumoral lymphangiogenesis route into the peri-SMA neural plexuses.

Pancreatic neoplasms; Neoplasm metastasis; Lymphatic vessels; D2-40; Micrometastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.06.001

國家自然科學基金(30772139)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院普外三科(程鵬、金鋼、胡先貴、劉瑞、張怡杰、邵成浩、周穎奇)，病理科(陳穎)

金鋼，Email:jingang@sh163.com

胰腺癌神經(jīng)浸潤被認為是判斷胰腺癌預后的獨立指標[1]。本文應用新型淋巴管上皮特異性抗體D2-40[2-4]檢測胰腺導管腺癌組織中淋巴管的分布，探討其與胰腺癌神經(jīng)浸潤的相關(guān)性。