解讀“基因表達載體”

劉向華

高中生物人教版新課標教材《選修3·現代生物科技專題》中的“基因表達載體的構建”，是基因工程的基本操作程序中的第二步，也是基因工程的核心。

基因表達載體由目的基因(插入基因)、啟動子、終止子、標記基因(抗生素基因)等組成。教師要引導學生認識：啟動子是一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端；終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結構的DNA短片段；抗生素基因作為其標記基因。

基因表達載體構建的目的是為了使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能表達和發揮作用；啟動子的作用是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，通過翻譯過程，最終獲得所需要的蛋白質；終止子使轉錄在所需要的地方停止下來；標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。

1基因表達載體中的啟動子、終止子是目的基因帶有的，還是質粒上固有的

將供體生物的基因轉移到受體生物的細胞中，只有使用生物自身基因的啟動子、終止子才能比較利于基因的表達。如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構建基因表達載體時，不需要在質粒的目的基因前接上特定的啟動子、終止子，目的基因中已含有啟動子、終止子；如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的，只將基因的編碼序列導入受體生物中。目的基因中沒有啟動子、終止子，是無法轉錄的，因此，在構建基因表達載體時，由于質粒上不含有目的基因的啟動子、終止子，所以需要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。

2標記基因是質粒上固有的，還是后加上去的

目的基因是否導入受體生物中還需要有標記基因作為篩選標記。一般情況下，質粒載體在基因組中有1—2個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征。由于構建載體的目的不同，需要的標記基因也不同，有的標記基因是質粒上固有的，有的標記基因是需要另外加上的，例如有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因(或做成目的基因與標識基因的融合基因)，如綠色熒光蛋白基因等。

3相關訓練

圖1為某種質粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內切酶EeoRI、BamHI的酶切位點，ampr為青霉索抗性基因，tctR為四環素抗性基因，P為啟動因子，T為終止子，orj為復制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內的多種酶的酶切位點。

(1)將含有目的基因的DNA與質粒表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產物用DNA連接酶進行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產物有

、

、

3種。若要從這些連接產物中分離出重組質粒，需要對這些連接產物進行

(2)用上述3種連接產物與無任何抗藥性的原核宿主細胞接種到含四環的培養基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產物是

。

(3)目的蓮因表達時，RNA聚合酶識別和結合的位點是

，其合成的產物是

。

(4)在上述實驗中，為了防止目的基因和質粒表達載體在酶切后產生的末端發生任意連接，酶切時應選用的酶是

。

解析：基因工程中，一個重要的工具是限制性內切酶，因為肉眼看不見，所以學生理解起來有很大難度。應通過課本中的典型圖解分析，幫助學生理解。

由基因操作的基本步驟可知，對于運載體——質粒，用限制酶切割一次，形成2個黏性末端，斷開了兩個化學鍵；目的基因從原來的DNA分子上被切下來，形成了2個黏性末端，但需斷裂4個化學鍵。如果目的基因和質粒用同一種限制性內切酶來切割，則產生的黏性末端相同，這樣用DNA連接酶連接時，就會產生三種產物：目的基因——目的基因、質粒——質粒、目的基因——質粒。

變通來想，要想只得到目的基因——質粒這種產物，應讓二者兩端的黏性末端完全不同，則只有一種連接方式，則此時應用2種不同的酶來分別切割目的基因的兩端。

參考答案：(1)目的基因——載體連接物

載體——載體連接物目的基因——目的基因連接物分離純化

(2)載體——載體連接物

目的基因——載體連接物載體——載體連接物

(3)啟動子mRNA

(4)EcoRI和BamHI