基于表觀遺傳調控的中藥防治類風濕關節炎作用機制研究進展

林 也，李 鑫，楊 珍，唐 琳，張 婷，余黃合，丁長松，廖 菁，蔡 雄,，劉 良

(湖南中醫藥大學1. 中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地、2. 中醫診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；3. 廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；4. 澳門科技大學中藥質量研究國家重點實驗室，澳門 999078)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的，以關節疼痛、腫脹、晨僵、畸形和功能障礙為主要臨床表現的自身免疫性疾病，其病理特征為多關節滑膜慢性炎癥增生、血管翳形成、軟骨及軟骨下骨的破壞，最終導致關節畸形和功能障礙[1]。RA全球發病率約為0.5%～1%，我國患病率約為0.28%～0.36%，其5年致殘率高達30%～50%，是造成勞動力喪失及致殘的主要疾病之一[2]。RA確切病因尚不清楚，發病機制復雜，目前國內外臨床治療RA常用傳統緩解病情抗風濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)及生物制劑，也包括改善癥狀的非甾體類抗炎藥和糖皮質激素，但常用DMARDs，如甲氨蝶呤、來氟米特等存在療程長、病人難以耐受、明顯肝腎損害等毒副反應問題，而新型生物制劑價格昂貴，長期使用有可能誘發癌癥。中醫藥治療RA歷史悠久，其療效主要通過整體調節實現，對病情的緩解和治療均具有明顯優勢，且安全性較高，目前臨床上使用中醫藥治療RA已成為發展趨勢[3]。

表觀遺傳學(epigenetics)是指基因核苷酸序列不發生改變，基因的表達與功能發生可遺傳的改變，其調節機制主要包括DNA甲基化(DNA methylation)、組蛋白修飾(histone modification)和miRNA表達調控等。現代研究表明，在RA患者表觀基因組中，發現了DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達的改變，影響關鍵的炎癥和基質降解途徑，在RA的發病機制中起重要作用[4]。本文擬從表觀遺傳學在RA發生、發展中的機制，以及中藥單體成分和復方通過調控DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA對RA的作用進行闡述，以期從分子水平更深入闡明中藥防治RA的作用機制，為研發治療RA的藥物提供新的科學依據。

1 表觀遺傳學在RA發生發展中的機制

1.1 DNA甲基化與RADNA甲基化(DNA methylation)是由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化S腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)提供的甲基供體，將胞嘧啶(cytosine)轉化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)的過程，從而調節細胞分化與基因表達。越來越多研究顯示，DNA甲基化參與RA的發病過程，介導遺傳變異與患者結局之間的關系。

RA滑膜成纖維細胞(synovial fibroblast，RASF)異常增生是介導RA病情發展和關節破壞的關鍵因素。Takami等[5]研究顯示，RASF死亡受體3(death receptor 3，DR3)基因的CpG島呈高甲基化，使DR3蛋白水平表達降低，進而抑制RASF凋亡，導致滑膜增生。繆成貴等[6]研究發現，RA模型大鼠成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)中存在分泌性卷曲蛋白1(secreted frizzled-related protein 1，SFRP1)表達下調，同時甲基CpG結合蛋白2(methyl CpG-binding protein 2，MeCP2)表達增高，Wnt經典通路關鍵基因β-catenin表達上調。對FLS使用甲基化抑制劑后，SFRP1表達不同程度上調，β-catenin表達不同程度下調，進一步說明在病變過程中發生了SFRP1基因甲基化，并且病變過程激活了Wnt經典通路。Sun等[7]探討MeCP2調節蛋白質修補同系物1(protein patched homolog 1，PTCH1)表達的分子機制，結果顯示，在RA中，MeCP2表達明顯升高，PTCH1明顯降低，發現MeCP2通過調控基因啟動子甲基化水平，降低FLS中PTCH1的表達，促進IL-6和TNF-α分泌，參與關節炎癥的產生。

1.2 組蛋白修飾與RA組蛋白修飾(histone modification)是在染色質的組蛋白上發生特異位點的翻譯后修飾，常見的組蛋白尾部修飾方式有乙酰化(acetylation)、甲基化(methylation)、磷酸化(phosphorylation)、泛素化(ubiquitination)、小類泛素化等，其中乙酰化修飾最常見。組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)通過調節組蛋白或轉錄因子的乙酰化狀態，來調節基因的活化或沉默，其中HDACs被認為在促炎基因轉錄調控中起重要作用，其抑制劑常用于RA的發病機制研究。

Zhang等[8]研究發現，曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)是HDACs抑制劑，可明顯抑制RASF的活力，并誘導細胞凋亡，亦可降低基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)的表達，以及抑制Akt的磷酸化。Chung等[9]證實了HDACs抑制劑FK228能使滑膜細胞中組蛋白過度乙酰化，降低TNF-α和IL-1β水平，并抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)產生，阻斷滑膜血管增生。李會丹等[10]探索HDACs在IL-17上調RA滑膜細胞中重組人富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61)表達過程中的調控機制，發現HDAC1通過影響核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，參與IL-17促進RA滑膜細胞中Cyr61的表達(Fig 1)。Tarcic等[11]研究發現，E3泛素連接酶RNF20/RNF40可以使組蛋白H2B單泛素化，引起NF-κB下游基因的組蛋白H3K9三甲基化，使相關基因表達在轉錄水平受到抑制。

Fig 1 Histone modification pathway of RA

TSA, an inhibitor of HDACs, inhibits RASFs and reduces the expression of MMP-2, MMP-9, PI3K and phosphorylation of Akt. HDACs inhibitor FK228 promotes histone hyperacetylation in synoviocytes, which reduces TNF-α and IL-1β levels, and inhibits VEGC. HDAC1 participates in IL-17 by affecting NF-κB pathway and promotes the expression of Cyr61 in RASF.

1.3 miRNA與RAmiRNA是一類廣泛存在于生物體內的非編碼單鏈小分子RNA，miRNA通過與靶基因mRNA特定區域的結合而引起mRNA的降解或翻譯抑制，調控基因表達。近年來許多研究揭示RA患者存在miRNA的調節異常。

Li等[12]研究結果顯示，RA患者血清miR-155呈高水平表達，通過靶向調控細胞因子信號抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)的表達，導致TNF-α和IL-1β上調，參與關節炎性反應過程。Hong等[13]研究發現，RA患者滑膜中miR-143表達上調，胰島素樣生長因子結合蛋白5(insulin like growth factor binding protein 5，IGFBP5)作為miR-143的潛在靶向基因，其表達水平與miR-143呈負相關，低水平表達的IGFBP5使RASF對TNF-α刺激敏感，促進IL-6的產生和激活NF-κB通路，介導關節炎癥發生。Li等[14]探討miR-140-5p對RASF增殖和炎性細胞因子分泌的影響，研究發現，RASF中存在miR-140-5p下調，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)上調，miR-140-5p的下調或上調不僅明顯增加或降低TLR4的表達，還可以促進或抑制RASF增殖和IL-6、IL-8的分泌。此外，TLR4的過表達可以逆轉miR-140-5p對RASF的增殖和炎性細胞因子釋放的抑制作用。

2 中藥調控表觀遺傳對RA的作用

新近越來越多的研究表明，中藥通過作用于DNA甲基化、組蛋白修飾和 miRNA調控基因表達，在RA發生、發展中發揮重要作用(Tab 1)。

2.1 中藥通過調控DNA甲基化對RA的作用目前研究發現，RA患者基因組呈低甲基化水平，且與健康人群相比，其DNMT1 mRNA表達明顯增高。Shu等[15]探究瑞香素(daphnetin)抗RA的作用機制，結果顯示，瑞香素通過降低膠原性關節炎(collagen II-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達，導致促凋亡基因DR3、程序化死亡基因5、FasL、p53基因去甲基化，上調促細胞凋亡基因和蛋白質的表達，促進滑膜細胞凋亡。Liu等[16]探討烏頭湯對CIA大鼠DNA甲基化的影響，結果顯示，與正常組相比，CIA大鼠DNMT1 mRNA高表達；與CIA組相比，烏頭湯組大鼠DNMT1 mRNA表達明顯降低，提示烏頭湯可能通過抑制DNMT1 mRNA的表達，抑制大鼠滑膜增生，減輕關節炎癥狀。陳歡等[17]考察濕熱環境下，熱痹模型大鼠特征性甲基化基因及白虎加桂枝湯對熱痹特征性甲基化基因的調控作用，發現白虎加桂枝湯可能通過抑制大鼠熱痹模型特征性甲基化，下調基因Ahcy、Rpl3 mRNA的表達，促進熱痹特征性甲基化上調基因Agxt mRNA的表達水平，從而明顯改善模型大鼠足腫脹度和病理損傷。

2.2 中藥通過調控組蛋白修飾對RA的作用近年研究廣泛認為，HDACs抑制劑對RA具有預防保護作用，烏頭湯除了上述作用外，亦可作為非選擇性HDAC抑制劑(HDACIs)，影響組蛋白H3乙酰化，減輕大鼠足腫脹度，抑制滑膜增生，發揮抗炎免疫作用[16]。Wada等[18]研究發現，RA患者IL-6啟動子中組蛋白H3乙酰化的水平明顯升高，誘導RASF中IL-6水平升高。姜黃素可明顯抑制IL-6啟動子中組蛋白H3乙酰化，進而抑制IL-6 mRNA及蛋白的表達，從而抑制RA炎癥發生。王妍[19]研究顯示，黃芪與當歸配伍影響E3泛素連接酶靶點，通過蛋白質泛素化途徑，進而影響NF-κB及轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)介導的信號轉導通路作用于RA。

2.3 中藥通過調控miRNA對RA的作用新近研究發現，RA患者體內的miR-146a表達明顯增加，miR-146a抑制輔助性T細胞1(Th1)介導的細胞反應，激活Treg細胞。雷公藤可明顯降低RA患者體內miR-146a的表達，抑制關節炎癥，改善患者臨床癥狀[20]。而另有研究顯示，miR-146a與RA患者的C反應蛋白、血沉水平呈負相關，益氣清絡方可上調RA患者外周血單個核細胞中miR-146a的表達水平，而miR-146a增高的意義可能在于抑制炎癥反應的強度，減輕炎癥反應對機體的損傷[21]。彭桉平等[22]研究證實，雷公藤內酯醇通過抑制miR-155的表達，上調單核細胞中SOCS1和SH2結構域肌醇5-磷酸酶1(Src homology 2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1，SHIP1)的表達，進而抑制RA患者外周血單核細胞中TNF-α、IL-6的炎癥反應，從而緩解RA患者風濕病情。朱亞梅等[23]探討清絡通痹方對CIA小鼠miRNA網絡的調控作用，結果發現，多種miRNA的異常表達參與CIA的病理過程，清絡通痹方可能通過干預miR-143，影響RA的免疫、炎癥、疼痛等多種病理過程。另有研究顯示，破骨細胞分化后期，miR-140-5p下調較為明顯，而清絡通痹方干預后可上調miR-140-5p的表達水平，參與調控破骨細胞的分化，抑制RA骨破壞的發生[24]。馮知濤[25]研究表明，清風痛膠囊聯合MTX通過下調RA患者外周血miRNA-146a和miRNA16的表達，抑制細胞因子TNF-α、IL-1β的分泌及滑膜細胞增殖，抑制過度的炎癥反應，從而減輕關節炎癥。

Tab 1 Effect of Chinese herbal medicine on epigenetic regulation of RA

3 總結與展望

綜上所述，新近越來越多的研究都證實表觀遺傳修飾參與了RA發病的各個機制，而中藥通過表觀遺傳修飾治療RA是一個全新的研究方向，初步揭示了中藥通過調節表觀遺傳修飾，對病情的緩解和治療均具有獨特的優勢。但中藥對RA的表觀遺傳學研究仍存在一些問題：其一，RA病因不明確，發病機制復雜，目前尚未完全闡明；其二，現有的中藥研究主要是針對某一靶標而進行的，忽略了中藥治療RA是通過多個靶標共同作用而發揮整體藥效；其三，表觀遺傳主要研究的是在DNA序列不變的情況下，基因表型功能的可逆、可遺傳改變，通過相互作用，多途徑、多層次影響和調控著遺傳基因的功能與特性，其作用機制亦復雜多樣，且尚處于起步階段。中藥治療RA的作用與表觀遺傳修飾均是多途徑、多靶點、多機制的綜合效應。因此，如何建立有效的研究手段闡明其多途徑、多靶點、多機制的關系，是未來工作的難點和重點。希望未來對中藥防治RA表觀遺傳調節機制的詳盡掌握，為中藥現代化奠定堅實的理論基礎。