綠色熒光蛋白簡介

劉曉萃 王明召

摘要 以高中化學新課標教材中有關氨基酸、蛋白質的知識為切入點,介紹綠色熒光蛋白的結構特點、生色團與發光特性、優點及應用,為一線教師提供前沿化學知識。

關鍵詞 高中化學;綠色熒光蛋白;新課標

中圖分類號:G633.8 文獻標識碼:B 文章編號:1671-489X(2009)24-0030-02

Introduction of Green Fluorescent Protein: To Help Implementation of New Curriculum Standard//Liu Xiaocui, Wang Mingzhao

Abstract The structure, chromophore, fluorescent property, advantage and application of the green fluorescent protein was briefly introduced in this paper, aimed to offer the frontier chemistry for the senior chemistry teachers.

Key words senior chemistry; green fluorescent protein; new curriculum standard

Authors address Institute of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing, 100875, China

近年來,綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)因其穩定性和獨特發光性能而成為在分子生物學、醫藥學、細胞生物學等領域廣泛應用的工具。2008年,瑞典皇家科學院將諾貝爾化學獎授予GFP的發現者和推廣者下村修、馬丁·查爾菲和錢永健,并將GFP的發現和改造與顯微鏡的發明相提并論。

1 發光特性

從水母分離出的GFP呈非常穩定的球狀結構,顯酸性,分子量為27×103 D,含238個氨基酸。GFP是一個生物發光系統,具有激發后能發射熒光的發光色基。它能吸收藍光(在395 nm具有最大吸收),發射綠色(或黃綠色)熒光,最大發射波長509 nm,并在470 nm處有一肩峰。只有完整的GFP分子才會產生生物熒光,切斷的GFP(即使只切掉C、N末端的少數幾個氨基酸)喪失發光能力[1,2]。

2 結構特點

GFP呈非常特殊的β罐折疊方式(圖1)。11條β折疊片形成一個桶狀結構,1條α螺旋纏繞在桶的軸位置,生色團附著在α螺旋上,包埋于中心[3,4],受到保護。β折疊片彼此緊密結合,形成一個規則的氫鍵帶,構成外圍桶板。桶狀結構、其末端的α螺旋、環狀生色團一起組成一個單獨的致密結構域,其他分子不能擴散進入,因此具有很好的抗熱、抗變性劑能力。由于酶很難進入其內部,生色基團的生成只能自催化進行[5]。

3 生色團與發光[3-6]

生色團是GFP發出熒光的物質基礎,位于64～69位氨基酸。第65位絲氨酸(Ser65)—第66位脫氫酪氨酸(Tyr66)—第67位甘氨酸(Gly67)通過共價鍵形成對羥苯甲基咪唑環酮,形成一個相當穩定的環狀三肽,構成生色團的核心,如圖2所示。

生色團通過細胞內多種物質的作用或自催化作用都能產生,不受種屬的限制。它非常穩定,不易變性,用酸、堿處理或者加入鹽酸胍都不會使它失去熒光。處理后當pH值恢復中性或除去變性物時,其熒光又會恢復到變性前水平。生色團之間通過共價鍵結合。

早已發現生色團核心的形成是一個自催化過程,唯一的外部要求是存在分子氧,據此推斷β罐結構很可能是生色團形成的至關重要條件。β罐既對生色團起保護作用,又為其形成提供合適的反應空間。其中,Ser65的羰基碳與Gly67的酰胺氮之間的距離明顯比開環條件下短很多,這有利于內環的形成。

生色團的形成機理目前尚不十分清楚,一種可能的自催化形成機理如圖3所示。生色團的形成大致經過環化、脫水和氧化3個過程。在β罐中,Ser65的羰基碳與Gly67的酰胺氮之間成鍵環化(I→Ⅱ),并發生氫轉移(Ⅱ→Ⅲ)和脫去水分子(Ⅲ→Ⅳ),然后通過氧化形成穩定的環狀三肽(Ⅳ→Ⅴ)。這時形成的GFP(Ⅴ)雖然也具有和發光GFP相同的凝膠電泳行為,但不能發光。必須在分子氧存在的情況下,Tyr66由質子化狀態(酚羥基)脫氫轉變成脫質子態(酚鹽,Ⅴ→Ⅵ),GFP才能發光。原因是酸性酚的激發態遠大于其基態,只有脫質子態的能級才能匹配。

4 優點[1,2,7]

4.1 易于檢測GFP只需紫外光或藍光激發,即可發出用熒光顯微鏡甚至肉眼就可觀察到的綠色熒光,且靈敏度高,可識別單細胞水平的表達,還可定量檢測。它對活細胞基本無毒害,可以很方便地進行活體觀察。

4.2 熒光穩定GFP熒光強度高、穩定性高,無光漂白現象,在pH值7～12范圍內都可以正常發光,溫度超過65 ℃時才會變性使熒光消失,也能耐受長時間光照。

4.3 廣譜性GFP的表達幾乎不受種屬的限制,在微生物、植物、動物中都獲得成功的表達。也不受細胞種類和位置的限制,在各個部位都可以表達,在多種原核和真核生物細胞中都可表達發光。

4.4 易于載體構建GFP較小,編碼GFP的基因序列也較短,可以很方便地同其他序列一起構建多種質粒,不至于使質粒過大影響轉化頻率。野生型的GFP在某些植物和動物中表達很弱,可通過更換生色團氨基酸、改變堿基組分、除去內含子、更換強啟動子等方法加強表達。替換一些氨基酸可產生不同顏色的光,以適應不同研究的需要。

4.5 可進行活細胞定時定位觀察借助于近年激光掃描共聚焦顯微鏡和強大的計算機軟件,可進行三維顯示,通過GFP可實時觀察到外界信號刺激下目的蛋白的變化過程,使對活細胞中蛋白功能的研究更接近自然狀態。

5 應用[1,2,5,8]

5.1 用作報告基因和細胞標記最多和最成功的應用是GFP同宿主蛋白構成融合子來監測宿主蛋白的定位和最后歸宿,既能發出熒光又有宿主蛋白正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。GFP可融合于宿主蛋白的N端或C端,也可插入其內部。至今GFP已成功靶入大部分細胞器中,如質膜、細胞核、內質網、高爾基體、分泌小體、線粒體、液泡和吞噬體等。

5.2 研究活細胞的蛋白變化過程、細胞器動力學和內膜運輸通過GFP可研究某一蛋白在活細胞中的動態變化,藥物對蛋白功能影響的動態過程以及蛋白之間的相互作用,免除提純蛋白、標記上熒光染料、用顯微注射導入細胞的復雜操作,并可對信號轉導系統的某一蛋白進行動態跟蹤,研究其分子機制。

5.3 計算細胞生長速度在高水平組合型表達GFP的細胞品系中,在細胞生長的對數期,GFP發出的熒光信號與細胞的數量密切相關,可將熒光強度轉換成細胞濃度。

5.4 臨床診斷和基因治療研究GFP標記的抗原或抗體可作為一種簡便、快速的免疫診斷新技術。例如,利用基因工程技術表達的GFP HB Ve抗原融合蛋白兼有熒光和抗原活性,實現用GFP標記肝炎病毒抗原的目標。腫瘤的基因治療中用GFP作為標記基因,不但可以直接通過FITC系統觀察到基因轉化,而且可直接收集轉化細胞供試驗,大大縮短篩選時間。

6 展望[1,2,5]

目前GFP的基礎理論研究遠不如應用研究,應用中也存在許多問題。例如:熒光強度的非線性性質使其定量非常困難;新生GFP折疊和加工成為具有熒光活性形式的過程十分緩慢,某些快速過程如轉錄的激活過程還難以用該法進行研究;紫外激發對某些GFP有光漂白和光破壞作用,導致熒光信號快速喪失;多數生物具有微弱的自發熒光現象,并有著類似的激發和發射波長,這會影響某些GFP的檢測。隨著生物技術的發展,隨著GFP的基礎理論研究的深入,這些問題終將得到解決。GFP一定可以為人們揭開生命科學中許多至今還不為人知的秘密。

參考文獻

[1]唐孝青,等.綠色熒光蛋白及其應用的研究進展[J].陜西農業科學,2007(1):123-124

[2]何海健,等.綠色熒光蛋白及其在分子生物學上的應用[J].金華職業技術學院學報,2008,8(4):27-29

[3]趙華,等.綠色熒光蛋白及其在植物分子生物學研究中的應用[J].植物生理學通訊,2003,39(2):171-178

[4]Zimmer M.GreenFluorescentProtein(GFP): Applications,Structure, and Related Photo physicalBehavior[J].Chem. Rev.,2002,102(3):759-782

[5]劉祖強,等.綠色熒光蛋白的結構、發光機制及其應用研究[J].武漢大學學報:自然科學版,2000,46(2):211-214

[6]Barondeau D P,et al.Understanding GFP Chromophore Biosynthesis:Controlling Backbone Cyclization andModifying Post-translational Chemistry[J].Biochemistry,2005,44(6):1 960-1 970

[7]鄭玥婷.綠色熒光蛋白的原核表達、純化以及抗體制備[J].氨基酸和生物資源,2005,27(1):40-43

[8]岳莉莉,等.用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統高效表達綠色熒光蛋白標記的HB Ve抗原[J].病毒學報,1998,14(3):234-239