同型半胱氨酸誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞氧化損傷的研究

蘇　娟　王樹人　吳建新　秦　燕

【摘要】 目的 探討同型半胱氨酸(Hcy)對(duì)人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)氧化損傷的作用及機(jī)制。方法 用含不同劑量Hcy（50~1000 μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs 24 h后，以分光光度比色法分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和超氧化物酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力的改變。結(jié)果 隨Hcy濃度增加，VSMCs內(nèi)MDA的含量明顯增加，SOD和CAT的活力也顯著升高。Hcy明顯促進(jìn)了VSMCs的氧化。結(jié)論 Hcy可直接誘導(dǎo)VSMCs的氧化損傷。

【關(guān)鍵詞】 同型半胱氨酸；平滑肌細(xì)胞；氧化損傷

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是近年來(lái)確定的致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)的新的獨(dú)立的危險(xiǎn)因子［1］。研究顯示，Hcy含有巰基(-SH)，易發(fā)生自身氧化，可生成如超氧化物、過(guò)氧化氫和羥自由基等多種強(qiáng)氧化物，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而損傷細(xì)胞［2］。Hcy對(duì)細(xì)胞的氧化作用，以往的研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞上。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs) 也是As發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞，Hcy對(duì)其是否有氧化作用卻少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討Hcy對(duì)VSMCs的氧化作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、新生牛血清（杭州四季清）、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、D-Hanks液；同型半胱氨酸 (Sigma)；MDA、SOD、CAT測(cè)定試劑盒（南京建成）。

1.2 人VSMCs的體外培養(yǎng)、鑒定與分組 采用組織貼塊法培養(yǎng)。取無(wú)菌的新鮮的人臍帶，剪取臍靜脈血管中膜部分并剪成約(0.5 mm×1 mm×1 mm~1.0 mm×1 mm×1 mm大小的血管小塊，以每3~5 mm2塊密度均勻種植于培養(yǎng)瓶底。采用DMEM/F12培養(yǎng)液，在37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱（濕度100%）內(nèi)靜置進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，并做α-actin肌動(dòng)蛋白免疫組化檢測(cè)。取3~6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分別置于終濃度為0、50、100、200、500、1000 μmol/L Hcy的培養(yǎng)液中孵育24 h，每組重復(fù)做5次。

1.3 方法 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，2000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清液。加入無(wú)菌的三蒸水，采用反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞。取上清液按說(shuō)明書，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）的含量，黃嘌呤氧化法比色測(cè)定細(xì)胞內(nèi)超氧化物岐化酶（SOD）的活力，可見(jiàn)光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫（CAT）的活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。采用SPSS 13.0軟件操作，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）的含量 由表1可見(jiàn)：VSMCs內(nèi)MDA的含量隨Hcy濃度的增加而增加，當(dāng)Hcy濃度達(dá)到 500 μmol/L以上與對(duì)照組有顯著差異性。

2.2 細(xì)胞內(nèi)超氧化物岐化酶（SOD）的活力 在Hcy作用下，VSMCs內(nèi)SOD的活力明顯升高，在低濃度（50 μmol/L）時(shí)就與對(duì)照組有差異性，并呈濃度依賴性升高。

2.3 細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫（CAT）的活力 VSMCs內(nèi)CAT活力也隨著Hcy濃度的增加而增加，但在高濃度（1000 μmol/L）時(shí)才與對(duì)照組顯示出差異性。

3 討論

Hcy是體內(nèi)蛋氨酸在代謝過(guò)程中經(jīng)脫甲基等一系列反應(yīng)形成的一種含硫氨基酸，在體內(nèi)含量極少。在正常成人體內(nèi)，血漿Hcy濃度大約為5~15 μmol/L。血漿中Hcy濃度>15 μmol/L稱為高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteine,HHcy)。1969年，McCully發(fā)現(xiàn)由于維生素B12的代謝障礙以及胱硫醚-β-合成酶(CβS)缺陷均可導(dǎo)致HHcy和類似As的病變；隨后他又通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)Hcy在血中蓄積可導(dǎo)致類似As的血管病變。據(jù)此，McCully提出HHcy與As有關(guān)的假說(shuō)［3］。近年大量的回顧性、前瞻性和實(shí)驗(yàn)性研究已確定，血漿中Hcy水平升高是As發(fā)病的一個(gè)新的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素［4］。

Hcy誘發(fā)As的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前尚未完全明了，研究認(rèn)為與氧化損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、凝血纖溶異常等作用有關(guān)［5］。其中，氧化損傷作用一直是Hcy引發(fā)As的研究重點(diǎn)。Tyagi等研究發(fā)現(xiàn)，Hcy在過(guò)渡金屬離子（Fe³⁺、Cu²⁺）的存在下易發(fā)生自身氧化，生成多種強(qiáng)氧化產(chǎn)物如超氧化物（O^-₂?）、過(guò)氧化氫（H₂O₂）和羥自由基（?OH）等，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，啟動(dòng)膜脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，降低膜流動(dòng)性并破壞細(xì)胞的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞功能改變，甚至壞死脫落［6］。高鍵等研究顯示，Hcy可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成，使血管內(nèi)皮細(xì)胞處于一種氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而使血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能上的損害。Hcy通過(guò)氧化損傷造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損害可能是HHcy導(dǎo)致As的始動(dòng)環(huán)節(jié) ［7］。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）也是As發(fā)生的主要效應(yīng)細(xì)胞。VSMCs的增殖、炎癥反應(yīng)、凋亡等病理變化也參與了As病程的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，在Hcy作用下，VSMCs內(nèi)MDA的含量明顯增加，與對(duì)照組比較有顯著性差異。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量能直接反映脂質(zhì)過(guò)氧化的速率和強(qiáng)度。說(shuō)明Hcy也可以直接引發(fā)VSMCs發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而使VSMCs出現(xiàn)氧化損傷。

本研究結(jié)果還顯示，在Hcy作用下，VSMCs內(nèi)SOD和CAT的活力明顯升高。SOD和CAT為體內(nèi)活性氧的清除劑。SOD可催化O^-₂?生成H₂O₂,H₂O₂在CAT作用下生成H₂O，從而消除自由基的毒性作用。本研究認(rèn)為，SOD和CAT活力的升高對(duì)Hcy促VSMCs的氧化作用應(yīng)該是一種代償反應(yīng)。Moat等報(bào)道，HHcy患者血液中SOD、GSH-PX等抗氧化酶的活性是升高的［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，小劑量（50 μmol/L）Hcy作用下細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶（SOD）的活力就有了明顯改變，提示低濃度的Hcy就可促使VSMCs內(nèi)活性氧生成。而在高濃度（500~1000 μmol/L）Hcy作用下活性氧增多顯著，SOD和CAT活力的增高雖可拮抗活性氧的作用，但VSMCs內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)明顯，故MDA含量顯著升高，Hcy誘發(fā)VSMCs出現(xiàn)了明顯的氧化損傷，該作用可能也參與了HHcy致As的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

參 考 文 獻(xiàn)

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