γ干擾素體外誘導(dǎo)大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞ＩＤＯ表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 探討γ干擾素（IFN-γ）誘導(dǎo)大鼠脾臟樹突狀細(xì)胞（DC）的吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）的表達(dá)情況。方法 大鼠脾臟分離培養(yǎng)DC，進(jìn)行形態(tài)特征觀察，流式細(xì)胞術(shù)檢測DC的表型及確定其純度。分別用不同濃度的IFN-γ誘導(dǎo)作用DC后，熒光定量RT-PCR測定IDO mRNA的相對表達(dá)水平。結(jié)果 大鼠脾臟分離培養(yǎng)的DC純度可達(dá)80%以上，培養(yǎng)10d的DC具有典型的樹枝狀突起，CD80、CD86的陽性表達(dá)分別達(dá)75%、90%以上。IDO mRNA的表達(dá)水平隨IFN-γ的濃度的增大逐漸增加。結(jié)論 IFN-γ在體外能誘導(dǎo)大鼠脾臟DC的IDO表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 樹突狀細(xì)胞；吲哚胺-2，3-雙加氧酶；γ干擾素

[中圖分類號] R322.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）12-48-03

Study of γ-interferon-induced Expression of Indoleamine 2，3-Dioxygenase of Rat Spleen-derived Dendritic Cells in Vitro

ZHANG Jing1XU Jun2

1.Shanxi Medicine University；2. General Surgery of Shanxi Province People's Hospital，Taiyuan 030012

[Abstract] Objective To study the effect of γ-interferon（IFN-γ） on the indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO） expression in rat spleen-derived dendritic cells（DC）. Methods DC were isolated and cultured from spleen in rat. The morphology of DC observed by microphotograph. The purity and phenotype were analyzed with flow cytometry. Separately with different concentrations of IFN-γ induced DC，relative expression of IDO mRNA were detectec by fluorescence quantitative RT-PCR. Results The purity of cultured DCs above 80%.DCs cultured at 10 days with typical dendritic morphogy. The positive expression of CD80 and CD86 were more than 75% and 90%.Expressions of IDO mRNA with the concentration of IFN-γ increased gradually increase. Conclusion IFN-γ could induce the expression of IDO of rat spleen-derived DC in vitro.

[Key Words] Dendritic cells； Indoleamine 2，3-dioxygenase； γ-interferon

樹突狀細(xì)胞（DC）是機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，不僅參與對外來抗原的免疫反應(yīng)，而且在誘導(dǎo)免疫耐受中也起著重要的作用。DC可通過多種機(jī)制誘導(dǎo)免疫耐受。最近有研究表明，DC還可能通過產(chǎn)生吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）來降低T淋巴細(xì)胞活性、抑制T淋巴細(xì)胞增殖[1-2]，誘導(dǎo)免疫耐受。因此，上調(diào)DC細(xì)胞的IDO表達(dá)可能為誘導(dǎo)移植后免疫耐受的新策略。本研究觀察在γ干擾素（IFN-γ）作用下DC的IDO表達(dá)情況，為今后IDO應(yīng)用于防止移植免疫排斥反應(yīng)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone公司，重組大鼠粒細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組大鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）、重組大鼠干擾素γ（IFN-γ）購自美國Pepro Tech公司，脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司，PE標(biāo)記的抗大鼠OX62購自英國AbD serotec公司，PE標(biāo)記的抗大鼠CD80、FITC標(biāo)記的抗大鼠CD86購自美國eBioscience公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，IDO與β-actin引物和TaqMan探針由上海基康生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)。

1.1.2動物來源Wister大鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，8~10周，體重200~250g。

1.2方法

1.2.1脾臟DC的分離與培養(yǎng)頸椎脫臼法處死大鼠，75%酒精浸泡，無菌取出脾臟，放入盛RPMI 1640 10mL的10cm培養(yǎng)皿中；將脾臟剪碎成1~2mm3的組織塊，碾磨過200目濾膜，將細(xì)胞懸液收集于15mL離心管中，1000r/min離心10min，棄上清；細(xì)胞沉淀中加入3mL PBS液，用吸管輕輕吹打混勻，加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液，冰上放置15min，期間輕輕渦旋混勻兩次，450×g離心10min，棄上清；向細(xì)胞沉淀加入2倍細(xì)胞壓積的紅細(xì)胞裂解液，充分重懸細(xì)胞，45×g離心10min，棄上清；PRMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；取15mL離心管，將Ficoll-Hypaque淋巴細(xì)胞分離液置于離心管底部，細(xì)胞懸液于細(xì)胞分離液液面上，比例為2∶1；2500r/min，離心25min；用吸管吸取中間白霧層置于另一干凈離心管，用D-Hank's漂洗液洗滌1次；PRMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，接種于12孔培養(yǎng)板，每孔2mL。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)2h；全量換液，用預(yù)熱的PRMI 1640完全培養(yǎng)液沖洗，充分去掉懸浮細(xì)胞；加入PRMI 1640完全培養(yǎng)液，添加細(xì)胞因子GM-CSF（30ng/mL）、IL-4（40ng/mL）；37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔天半量換液一次，添加細(xì)胞因子；第8天加入LPS 1μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48h后收集半貼壁細(xì)胞。

1.2.2DC的形態(tài)學(xué)觀察在培養(yǎng)的過程中，每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況、形態(tài)，集落的數(shù)量和大小，以及培養(yǎng)基是否受污染，并拍片。

1.2.3細(xì)胞表型分析收集培養(yǎng)10d的DC，PBS緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（1~2）×106/mL。每管加細(xì)胞懸液200μL，分別加入PE標(biāo)記的抗大鼠CD80 2.5μL和FITC標(biāo)記的抗大鼠CD86 1μL，或者PE標(biāo)記的抗大鼠OX-62 10μL；避光，放置30min，4000r/min，離心5min，棄上清；PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，每管加生理鹽水500μL重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析。

1.2.4不同濃度IFN-γ對DC的作用細(xì)胞培養(yǎng)第9天分成四組，分別以0、100、300、500U/mL的濃度加入IFN-γ，繼續(xù)培養(yǎng)18h后，收集半貼壁細(xì)胞用于IDO mRNA的檢測。

1.2.5熒光定量PCR測定IDO mRNATrizol試劑提取不同濃度IFN-γ作用后的DC總RNA，根據(jù)Fermentas RT-PCR試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。大鼠IDO擴(kuò)增片段上游引物為5’-TGAAGATGTGGGCTTTGCTCTA-3’，下游引物為5’-GGCAGATTTCTAGCCACAAGGA-3’，TaqMan探針序列為（FAM）ACATCCACTGGAGGAGCTGCCTGATACG。采用β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)體系為25μl，在StepOne TM實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行相對定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件為94℃ 2min；94℃ 20s，60℃ 40s，循環(huán)次數(shù)為40次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用單因素方差分析（ANOVA）方法，各組測得值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（χ±s）表示，P＜0.05為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1DC的形態(tài)學(xué)觀察

新分離的DC呈圓形，胞體小；培養(yǎng)第3天胞體圓，無突起；培養(yǎng)第7天出現(xiàn)毛刺狀細(xì)胞，毛刺短，細(xì)胞呈集落生長（圖1）；培養(yǎng)第10天加LPS刺激后，樹突狀突起明顯，出現(xiàn)典型的DC形態(tài)（圖2）。

2.2細(xì)胞表型分析

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，80%以上培養(yǎng)10d的DC表達(dá)大鼠DC特異性表達(dá)分子OX-62（圖3）；DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達(dá)分別為75%和90%以上（圖4）。

2.3IFN-γ作用下DC的IDO mRNA表達(dá)

StepOne軟件分析結(jié)果示，IFN-γ濃度為0U/mL的DC作為對照，IDO mRNA相對值的均數(shù)為1，其他三組的mRNA相對值的均數(shù)分別為1.4624、1.4264和2.090。隨著IFN-γ的濃度增大，IDO mRNA的表達(dá)水平隨逐漸增加（圖5）。IFN-γ濃度為500U/mL組，IDO mRNA的表達(dá)水平明顯高于其他兩組（P＜0.05）。

3 討論

隨著外科技術(shù)的日臻完善，器官移植已廣泛開展，但如何控制移植后的免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)宿主對移植物產(chǎn)生免疫耐受，延長移植物的存活時間一直是人們所期待解決的問題。DC是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的參與免疫耐受的抗原提呈細(xì)胞。吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）是細(xì)胞內(nèi)一種亞鐵血紅素的酶，是肝臟以外惟一可催化色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶。

研究發(fā)現(xiàn)，IDO至少通過兩種機(jī)制引起免疫耐受：①T細(xì)胞增殖中的G1期中期對色氨酸非常敏感，IDO過度表達(dá)使色氨酸缺乏，T細(xì)胞不能有效的增殖和激活[4]；②通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖，產(chǎn)生大量IL-10和TGF-β來抑制T細(xì)胞的免疫功能[5]。

IFN-γ主要分布于細(xì)胞表面的高親合力的受體IFN-γR（IFN-γ-receptor，IFN GR）來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的，INF-γ通過與受體結(jié)合后使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（STA T1）與IDO 啟動子的活化序列GAS-2和GAS-3 結(jié)合，誘導(dǎo)IDO 的表達(dá)。也可通過刺激細(xì)胞合成IRF-1，IRF-1 結(jié)合于IDO基因上游的ISRE-1 和ISRE-2 從而誘導(dǎo)IDO 的表達(dá)[6-8]。本研究從大鼠脾臟提取DC，經(jīng)紅細(xì)胞裂解、淋巴細(xì)胞分離及手法篩選，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定純度高；通過觀察IFN-γ作用下DC的IDO表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以明顯上調(diào)IDO mRNA的表達(dá)，且其表達(dá)水平與IFN-γ呈劑量依賴性，IFN-γ500U/mL組的IDO mRNA的表達(dá)水平為對照組的2倍，這為IDO運(yùn)用于誘導(dǎo)抑制免疫耐受提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2009-03-02）