IL-10\\MMP-9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及預(yù)后的相關(guān)性

[摘要] 目的 研究IL-10及MMP-9在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，探討其與NSCLC的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)60例非小細(xì)胞肺癌及20例肺良性病變組織中IL-10及MMP-9的表達(dá)水平;運(yùn)用單因素(log-rank)生存分析比較IL-10及MMP-9與各臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果 IL-10及MMP-9在NSCLC中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于肺良性病變組織(P<0.05)，IL-10及MMP-9表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，同時(shí)IL-10低表達(dá)組的生存時(shí)間要低于高表達(dá)組，MMP-9低表達(dá)組的生存時(shí)間則顯著高于高表達(dá)組(P<0.05)，IL-10高表達(dá)、MMP-9低表達(dá)可能對(duì)NSCLC的預(yù)后產(chǎn)生影響。結(jié)論IL-10及MMP-9在NSCLC中的表達(dá)狀態(tài)是NSCLC的影響因素，二者的表達(dá)具有相關(guān)性，IL-10可能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，監(jiān)測(cè)IL-10及MMP-9的表達(dá)對(duì)評(píng)估NSCLC患者的預(yù)后具有重要作用。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;IL-10;MMP-9;免疫組織化學(xué);預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701(2009)28-01-04

腫瘤流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在美國(guó)腫瘤已成為死亡的首位原因，發(fā)展中國(guó)家，肺癌的發(fā)生率一直呈上升趨勢(shì)[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者的80%～85%，其5年生存率僅15%左右[2]，而細(xì)胞免疫發(fā)揮著抗腫瘤的主導(dǎo)作用。故探討NSCLC細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，可能對(duì)預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后具有重要意義。現(xiàn)應(yīng)用免疫組化，研究IL-10、MMP-9在NSCLC中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系，探討其與肺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的關(guān)系及預(yù)后意義。

1材料與方法

1.1一般資料

選取南京市胸科醫(yī)院胸外科自1995年以來(lái)，所有確診和疑似NSCLC的手術(shù)病例60例和20例肺良性病變組織，術(shù)前均未做放療或化療，術(shù)中均行7～8組以上淋巴結(jié)清掃，所有標(biāo)本送病理科檢查，術(shù)后進(jìn)行系統(tǒng)后續(xù)治療，其中，男性41例，女性19例，年齡37～83歲，中位年齡65歲。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，肺癌組織學(xué)分類按世界衛(wèi)生組織(WHO)2004年肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌32例，腺癌22例，6例為其他類型(大細(xì)胞癌、鱗腺癌、類癌)。根據(jù)1997年UICC的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分為I期16例，II期40例，III期4例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16例。

1.2免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-10及MMP-9的表達(dá)

全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色。免疫組織化學(xué)選用SP法測(cè)定，鼠抗人IL-10單克隆抗體、鼠抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Biosource公司，光譜超敏SP試劑盒及DAB顯色液等為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。上述標(biāo)本經(jīng)HE染色和IL-10、MMP-9染色，參照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化SP法檢測(cè)。

1.3結(jié)果判斷

以PBS代替一抗設(shè)定為陰性空白對(duì)照，同時(shí)用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。IL-10和MMP-9以細(xì)胞漿中有黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。蛋白累積的評(píng)分方法:參照Fromwitz綜合計(jì)分法并略加修改行半定量分析，在400倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。著色強(qiáng)度呈淺棕色為1分、棕色為2分、深棕色為3分。綜合評(píng)分，<2分為陰性，2~4分為陽(yáng)性，>4分為強(qiáng)陽(yáng)性。雙盲法讀片[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，各因素對(duì)生存的影響采用Log-Rank 檢驗(yàn)，生存期按Kaplan-meier方法制作累計(jì)生存曲線，影響因素的多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型。結(jié)果均以雙側(cè)P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1IL-10及MMP-9在NSCLC中的表達(dá)

免疫組化染色顯示IL-10表達(dá)位于NSCLC和非肺癌組織的細(xì)胞漿中，腫瘤周圍的淋巴細(xì)胞偶見(jiàn)IL-10染色;正常支氣管上皮細(xì)胞亦可見(jiàn)IL-10染色，而支氣管周圍腺細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性染色(圖1，2)。MMP-9主要定位于腫瘤細(xì)胞胞漿、胞膜、間質(zhì)的纖維細(xì)胞及少量血管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞漿多見(jiàn)(圖3)。正常肺泡上皮和支氣管黏膜上皮呈陰性表達(dá)。

IL-10在NSCLC和肺良性病變組織中表達(dá)的陽(yáng)性率分別為72%(43/60)、5%(1/20)，可見(jiàn)IL-10在NSCLC組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。NSCLC組織中MMP-9表達(dá)的陽(yáng)性率為60%(36/60)，肺良性病變組織中未見(jiàn)表達(dá)。

2.2IL-10、MMP-9在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性

NSCLC組織中IL-10、MMP-9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=0.460，P =0.000)。詳見(jiàn)表1。

2.3NSCLC患者預(yù)后的單因素分析

60例NSCLC患者從手術(shù)日期開(kāi)始隨訪，均隨訪4年以上，至患者死亡結(jié)束，未死亡者至2009年3月21日截止，中位生存時(shí)間34個(gè)月。單因素分析顯示，患者年齡、性別、吸煙史及組織學(xué)類型的對(duì)其生存期均無(wú)影響(P>0.05)，詳見(jiàn)表2，而腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、IL-10及MMP-9表達(dá)情況均對(duì)患者的生存期有顯著影響(P<0.05);IL-10表達(dá)陰性及MMP-9表達(dá)陽(yáng)性的患者生存期明顯縮短(圖4，5)。由此可見(jiàn)IL-10高表達(dá)、MMP-9低表達(dá)都是NSCLC的預(yù)后影響因素。

3討論

NSCLC目前已居人類惡性腫瘤發(fā)生率的前列，外科手術(shù)是早中期NSCLC首選的治療方法，但同樣是根治手術(shù)，患者的預(yù)后仍存在較大差異，而細(xì)胞免疫發(fā)揮著抗腫瘤的主導(dǎo)作用，并與體液免疫相互作用，殺傷腫瘤細(xì)胞，白細(xì)胞介素是在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，它們與腫瘤發(fā)生的關(guān)系愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注，故探討細(xì)胞因子與其預(yù)后的關(guān)系有較大的現(xiàn)實(shí)意義。

IL-10是一種免疫抑制細(xì)胞因子，體內(nèi)多種細(xì)胞均可以產(chǎn)生，如:正常的新生細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等，其通過(guò)自分泌或旁分泌方式促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并抑制細(xì)胞程序死亡，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，且與肺癌免疫逃逸直接相關(guān)。NSCLC患者血漿中IL-10水平明顯升高[4]。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者IL-10陽(yáng)性率明顯高于肺良性病變組織，提示腫瘤的生長(zhǎng)與IL-10直接相關(guān)，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，通過(guò)免疫負(fù)性調(diào)節(jié)，在腫瘤免疫逃避中起重要作用。Soric研究亦提示，I期NSCLC患者中缺少IL-10的表達(dá)提示預(yù)后較差[5]。本實(shí)驗(yàn)中，NSCLC腫瘤細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)IL-10染色強(qiáng)陽(yáng)性，隨著T分期增加，IL-10的陽(yáng)性率下降，生存期亦隨之縮短，與Soric等的研究結(jié)果一致。但亦有研究提示，在進(jìn)展期NSCLC患者中，血漿IL-10水平與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[6]，相對(duì)于健康志愿者，NSCLC患者中血漿IL-10水平明顯升高，對(duì)于治療有效組，IL-10水平明顯下降[7]。提示IL-10作為免疫抑制因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，根據(jù)其所處微環(huán)境的不同，發(fā)揮不同的免疫作用，故其參與腫瘤發(fā)展的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的先決條件是破壞基底膜的完整性，這一過(guò)程為瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的結(jié)果，基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)是鋅依賴性內(nèi)切酶超家族，幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，其中MMP-9是MMPS中相對(duì)分子質(zhì)量最大的酶，它以酶原形式分泌，被激活后形成IV型膠原酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)和IV、V、VII、X型基底膜膠原，增強(qiáng)腫瘤新生血管的形成，從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-9在胃癌、NSCLC、肝癌等腫瘤組織中均增高[8]。20%～65% NSCLC病理組織中均發(fā)現(xiàn)有MMP-9[9]，可見(jiàn)MMP-9首先通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞周圍的物理屏障，使其易于發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。Pinto[10]研究顯示，MMP-9的過(guò)度表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究亦表明，MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)在NSCLC中明顯高于肺良性病變組織，且隨著TNM分期的增加，MMP9表達(dá)的陽(yáng)性率顯著增高，提示MMP-9參與NSCLC腫瘤轉(zhuǎn)移的晚期過(guò)程，與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可用于評(píng)估病情。

腫瘤的轉(zhuǎn)移同時(shí)需伴隨著新生血管的生成。大量實(shí)驗(yàn)證明，癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞外MMPS的能力密切相關(guān)。NSCLC病理切片顯示MMP-9表達(dá)增加，同時(shí)伴隨著新生血管的生成[11]。IL-10可以直接作用于腫瘤細(xì)胞或間接作用于浸潤(rùn)相關(guān)的免疫細(xì)胞，抑制腫瘤內(nèi)新生血管形成，抑制腫瘤生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。小鼠動(dòng)物模型中，給予IL-10可抑制腫瘤代謝及刺激免疫細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)[11]。Zhang等報(bào)道，用非毒性劑量IL-10分別注入實(shí)驗(yàn)性和自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有效抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移，且呈劑量依賴性。NSCLC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者M(jìn)MP-9陽(yáng)性率顯著升高，而IL-10陽(yáng)性率反而有所下降，二者呈顯著的負(fù)相關(guān)，提示IL-10的高表達(dá)可能通過(guò)抑制了MMP-9的產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Stearns等的研究亦有類似發(fā)現(xiàn)，當(dāng)表達(dá)IL-10的人原始前列腺癌細(xì)胞被種植到SCID小鼠體內(nèi)，新生血管生成和轉(zhuǎn)移受到明顯抑制，更為重要的是，種植表達(dá)IL-10腫瘤細(xì)胞的小鼠的存活率達(dá)到85%[12]。Huang S等[13]報(bào)道:將用小鼠IL-10 CDNA轉(zhuǎn)染的人惡性黑色素瘤細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有少量肺轉(zhuǎn)移，并且腫瘤的生長(zhǎng)明顯受到抑制。這是由于IL-10抑制了腫瘤新生血管的形成。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中IL-10及MMP-9的表達(dá)具有一致性的結(jié)論相一致。

IL-10與MMP-9均是影響NSCLC患者預(yù)后的因素，并且二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)監(jiān)測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)能夠更加精確的判斷NSCLC患者的預(yù)后，值得臨床應(yīng)用。

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(收稿日期:2009-07-28)