蝦青素分析測(cè)定方法的研究

【摘 要】選擇分光光度法及高效液相色譜法對(duì)測(cè)定蝦青素的分析條件進(jìn)行研究，從而得出最佳的測(cè)定條件。用分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定蝦青素，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的R2都超過(guò)了0.99。用分光光度法測(cè)定蝦青素，回收率范圍為99.3-101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.78-1.3%；用液相色譜法測(cè)定蝦青素，回收率范圍為100-102% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.62-1.4%。這些值都在定量分析所要求的閾值范圍內(nèi)，可以用于定量分析。

【關(guān)鍵詞】分光光度法；高效液相色譜法；蝦青素

Abstract： Choice two based on the spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC) were developed for determination the astaxanthin. And the optimum conditions was investigated in detail. The total amount of astaxanthin was measured by spectrophotometry， the recoveries were in the range of 99.3-101%， and RSD were in the range of 0.78 %-1.3 %. Also the astaxanthin was determined by HPLC， and the recoveries were in the range of 100% -102%， RSD were in the range of 0.62%-1.4%. All these values were within the range of permissive threshold value on quantitative analysis， which showed that it’s feasible for measuring the content of astaxanthin by these two methods.

Key words: spectrophotometry；HPLC；astaxanthin

從動(dòng)植物及菌類(lèi)中提取蝦青素目前還處于實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)階段，要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)蝦青素，還必須對(duì)其提取工藝進(jìn)行廣泛深入的研究。要開(kāi)展這方面的研究，必須建立起快速、高效、簡(jiǎn)便的蝦青素分析方法。蝦青素是一種類(lèi)胡蘿卜素[1]，分光光度法和高效液相色譜法是常用的兩種類(lèi)胡蘿卜素分析方法[2，3]，這兩種方法各有特點(diǎn)：類(lèi)胡蘿卜素分子因其分子結(jié)構(gòu)中的共軛雙鍵體系及離域化的π電子，在可見(jiàn)光區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)吸收帶，且每種類(lèi)胡蘿卜素分子的最大吸收峰位置與紫外可見(jiàn)光光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)都是具有特征性的。由于類(lèi)胡蘿卜素分子的這種光吸收性質(zhì)，溶液中的類(lèi)胡蘿卜素一般服從Beer-Lambert定律，所以通過(guò)分光光度法可實(shí)現(xiàn)對(duì)其精確的定量分析[4]；高效液相色譜法具有分離速度快，在線檢測(cè)（如UV 檢測(cè)器），靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是美國(guó)NFIA（美國(guó)飼料協(xié)會(huì)）規(guī)定的測(cè)定方法。本工作旨在通過(guò)對(duì)分光光度法和液相色譜法測(cè)定蝦青素的研究，從而建立快速、有效、準(zhǔn)確的測(cè)定蝦殼中蝦青素的方法。

一、材料和方法

（一）材料

（1）儀器：721型分光光度計(jì)（上海精科食品廠）

高效液相色譜儀（日本島津公司）

Ｃ18 色譜柱：250 mm×4.6 mm（迪馬公司）

恒溫箱 202-1 型(上海市上海縣試驗(yàn)儀器廠)

JA2003 上皿電子天平（上海天平儀器廠）

（2）試劑：蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，美國(guó)sigma公司）；乙腈（色譜純）；甲醇、無(wú)水乙醇、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

（1）分光光度法

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的蝦青素純樣品多份，分別用乙醇有機(jī)溶劑溶解后各自配制成1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、6.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用721型分光光度計(jì)測(cè)定不同波長(zhǎng)下的吸光度。在最大波長(zhǎng)下，以試劑空白調(diào)零，測(cè)其吸光度。

以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）高效液相色譜法

1. 色譜工作條件

色譜柱：C18（250mm×4.6mm）。流動(dòng)相：乙醇：甲醇：二氯甲烷＝75：15：10（V/V），流速為1.0mL/min。柱溫：室溫。檢測(cè)波長(zhǎng)為480nm，進(jìn)樣量20μL。

2. 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

稱(chēng)取一定量的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇配制濃度分別為1.0 μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL、8.0μg/mL、10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20μL進(jìn)樣，根據(jù)峰面積與相應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

二、結(jié)果與分析

（一）分光光度法分析蝦青素

（1）蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙醇溶劑中的最大吸收波長(zhǎng)

我們將蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶解在乙醇溶劑中，在400 nm 至700 nm范圍內(nèi)測(cè)其吸光度，結(jié)果如圖1。從圖中可以看出，蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙醇溶劑中的最大吸收波長(zhǎng)為474 nm。

（2）蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品在乙醇有機(jī)溶劑中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的蝦青素純樣品多份，分別用乙醇有機(jī)溶劑溶解后，以試劑空白調(diào)零，用721型分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖2。

條件：測(cè)定波長(zhǎng)λ=474nm

從圖2中可以看出，在乙醇溶劑中蝦青素濃度與其吸光度具有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2大于0.999），通過(guò)測(cè)得的吸光度按其線性回歸方程可計(jì) 算蝦青素的濃度。

（3）回收率和精密度試驗(yàn)

精密稱(chēng)取蝦青素10.00mg，置100mL容量瓶中，分別加入濃度為100μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2mL、3mL、4mL，用乙醇溶解并稀釋至刻度。用新建立的方法對(duì)其進(jìn)行分析，計(jì)算回收率及精密度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

條件同圖2

從表1可以看出，蝦青素的回收率范圍為99.3%-101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.78%-1.3%。

（二）液相色譜法分析蝦青素

（1） 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于HPLC的檢測(cè)器是紫外檢測(cè)器，綜合考慮乙醇有機(jī)提取溶劑的最大吸收值及靈敏度，最終選擇紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm。

（2） 色譜柱類(lèi)型的選擇

利用高效液相色譜法測(cè)定色素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，大部分都是使用C8或C18為填料的反相液相色譜法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件，采用了填料為C18的色譜柱來(lái)進(jìn)行蝦青素的液相色譜測(cè)定試驗(yàn)。

（3） 流動(dòng)相及其他色譜條件的選擇

甲醇、乙腈、四氫呋喃、水、甲醇、二氯甲烷、丙酮等是高效液相色譜法中最常用的流動(dòng)相。在反相色譜中極性大的組分因K值較小先流出色譜柱，極性較小的組分后流出。流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例增加，流動(dòng)相極性減小，洗脫力增強(qiáng)。用水-甲醇作為流動(dòng)相，顯然比較經(jīng)濟(jì)，但我們?cè)囼?yàn)的結(jié)果是出峰時(shí)間較后，且峰形較胖，所以本實(shí)驗(yàn)最終采用乙腈：甲醇：二氯甲烷＝75：15：10（體積比）作為流動(dòng)相，超聲波脫氣，進(jìn)樣前樣品用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為480nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫為室溫。

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及色譜圖

如上1.2.2.2配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按給定色譜條件試驗(yàn)，以峰面積（y）對(duì)各組分濃度（x）求回歸方程并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知：蝦青素濃度在1.0～10.0μg/mL 時(shí)，其濃度與峰面積成一直線關(guān)系。在此濃度范圍內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=139580x+3470，其中y：表示HPLC峰面積；x 表示游離蝦青素濃度（μg/mL）。相關(guān)系數(shù)R＝0.9999，線性相關(guān)性很好。圖4為蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖。由圖中可知出峰時(shí)間為7.432 min左右的峰為游離蝦青素。

（5）回收率和精密度測(cè)定

精密稱(chēng)取蝦青素10.00mg，置100mL容量瓶中，分別加入濃度為100μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5mL、6mL，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。用新建立的方法對(duì)其進(jìn)行定量分析，每個(gè)樣品平行做3個(gè)，計(jì)算回收率及精密度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

條件同圖4.

從表2中可以看出，蝦青素的回收率為100%-102%；蝦青素測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.62%-1.4%。

三、結(jié)論

利用蝦青素不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn)，將蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，利用分光光度法和高效液相色譜法對(duì)其蝦青素含量進(jìn)行測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的R2都超過(guò)了0.999，線性良好，能用于定量分析測(cè)定。用分光光度法測(cè)定蝦青素，回收率范圍為99.3-101％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.78-1.3％；用液相色譜法測(cè)定蝦青素，回收率范圍為100-102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.62-1.4%。這些值都在定量分析所允許的閾值范圍內(nèi)[5]，說(shuō)明用分光光度法和高效液相色譜法均可用來(lái)準(zhǔn)確地測(cè)定蝦青素。

參考文獻(xiàn)

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