蒽酮——硫酸比色法測(cè)定枇杷葉中可溶性多糖的含量

摘 要：目的：建立枇杷葉中可溶性多糖的含量測(cè)定方法。方法：采用蒽酮—硫酸比色法。結(jié)果：顯示624nm處有最大吸收峰，線性關(guān)系較好(r=0.9999)，平均回收率為99.58%(n=5，RSD=2.85%)，枇杷葉可溶性多糖的含量為8%以上。結(jié)論：該方法快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可為枇杷葉中水溶液多糖的檢測(cè)提供參考方法。

關(guān)鍵詞：枇杷葉多糖；蒽酮—硫酸比色法；含量測(cè)定

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-2197(2008)08-000-00

枇杷葉為薔薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥葉，在我國(guó)已有2200多年的栽培歷史。目前已報(bào)道枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸的含量測(cè)定方法，但是采用蒽酮比色法測(cè)定枇杷葉中水溶性多糖含量方法的研究報(bào)道較少^[1]。本試驗(yàn)探討了枇杷葉中水溶性多糖的含量測(cè)定方法，旨在為今后產(chǎn)業(yè)化利用枇杷資源的含量檢測(cè)提供參考。

1 材料

試驗(yàn)用枇杷葉采自成都中醫(yī)藥大學(xué)峨嵋學(xué)院植物種植園，由王書林教授鑒定為薔薇科(Rosaceae)植物枇杷(Eriobotrya japonica Thunb Lindl)的干燥葉。

1.1 試藥

無水葡萄糖(AR)、枇杷葉、蒽酮(AR)、硫酸(AR)、無水乙醇。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV2450紫外-可見分光光度計(jì)、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、101-2A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、W201C數(shù)控恒溫水浴鍋、SHB-Ⅲ循環(huán)水真空泵、2G 10-2.4A離心機(jī)。

2 方法

2.1 樣品溶液的制備

將枇杷葉洗滌后于60℃干燥，粉碎備用。精密稱取約10g，加水150mL，在80℃回流提取3h^[1]，趁熱過濾，重復(fù)提取一次，合并上述濾液，離心，上清液減壓濃縮至約25mL，精密吸取濃縮液10mL，加乙醇調(diào)含醇量至含乙醇量為85%，密閉置4℃冰箱中靜置過夜。回收乙醇，沉淀用水適量超聲溶解，搖勻定容至50mL，精密吸取上述定容液0.5mL用水定容至100mL作為待測(cè)液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖100.00mg，加蒸餾水100mL，配置成濃度為1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液備用。

2.3 蒽酮試液的配制^[3]

100mg蒽酮用76%稀硫酸(76mL濃硫酸加入30mL水中)定容到100mL，臨用新配。

2.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液0.0mL、0.5mL置具塞試管內(nèi)，分別加水1.0mL、0.5mL，加入新鮮配制的蒽酮試劑5.0mL，立即放入冰水浴中搖勻，置沸水浴中煮10min，取出冷水沖洗2min冷卻，靜置10min后以首管為空白，在500～700nm處掃描，結(jié)果在624±1nm處有最大吸收，因此選擇測(cè)定波長(zhǎng)為624nm。

2.3.2 蒽酮試劑用量的選擇

精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0mL，再吸取不同量的蒽酮試劑，立即放入冰水浴中搖勻，置沸水浴中煮10min，取出自來水沖洗2min冷卻，靜置10min后于624nm處測(cè)定，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，同法作空白，結(jié)果列表1。

2.3.3 水浴溫度的選擇

精密吸取對(duì)照品溶液1mL，蒽酮試劑5.0mL，立即放入冰水浴中搖勻，置不同溫度中煮10min，取出自來水沖洗2min冷卻，靜置10min后于624nm處測(cè)定，同法作空白，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，結(jié)果列表2。

2.3.4 水浴反應(yīng)時(shí)間的選擇

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，蒽酮試劑5.0mL，立即放入冰水浴中搖勻，置沸水浴中煮不同時(shí)間，取出自來水沖洗2min冷卻，靜置10min后于624nm處測(cè)定，取出，同法作空白，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，結(jié)果列表3。

2.3.5 靜置時(shí)間的選擇

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，蒽酮試劑5.0mL，立即放入冰水浴中搖勻，置沸水浴中煮10min，取出自來水沖洗2min冷卻，靜置不同時(shí)間后于624nm處測(cè)定，取出，同法作空白，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，結(jié)果列表4。

由吸收值可知，當(dāng)靜置時(shí)間為10min后，吸收值趨于穩(wěn)定，故選擇靜置時(shí)間為10min。

綜上結(jié)果可知，最佳的試驗(yàn)條件為：蒽酮試劑的用量為5.0mL、反應(yīng)溫度為100℃、水浴時(shí)間為10min、靜置時(shí)間為10min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL于25mL容量瓶中，加蒸餾水定溶搖勻，再分別吸取各濃度葡萄糖溶液1mL，加入5mL蒽酮試液，立即放入冰水浴中搖勻后，置沸水浴中煮10min，取出自來水沖洗2min冷卻，靜置10min后于624nm處開始測(cè)定，以蒸餾水1.0mL同上法作空白對(duì)照。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做回歸處理，得回歸方程為y=5.8839x+0.0015，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，葡萄糖在0.02～0.12mg范圍內(nèi)，與吸收度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精確量取樣品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，同法作空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值(A)，結(jié)果顯示：RSD=2.88%<3%(n=5)，表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精確量取樣品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，同法作空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值(A)，結(jié)果顯示：RSD=1.12%<3%，表明該方法測(cè)定的多糖在2h內(nèi)顯色穩(wěn)定，所測(cè)得的多糖含量穩(wěn)定。

2.5.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精確量取樣品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，同法作空白對(duì)照，分別測(cè)定其吸光度值(A)，結(jié)果顯示：RSD=2.91%<3%(n=5)，表明重現(xiàn)性良好。

2.5.4 回收率實(shí)驗(yàn)

分別精確量取1mL已知多糖含量樣品液(4份)，每份加0.3mL葡萄糖儲(chǔ)備液(1mg/mL)，搖勻，移至I0mL容量瓶中定溶作待測(cè)液，分別精確量取1mL待測(cè)液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，分別測(cè)定其吸光度值(A)，結(jié)果顯示：本方法的加樣平均回收率為99.58%，RSD=2.85%<5%(n=5)，可很好的用于中藥材中粗多糖含量的測(cè)定。

2.6 樣品液的測(cè)定

精確量取樣品液1mL(3份)，加入5mL蒽酮試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，同法作空白對(duì)照，測(cè)定其吸光度值，代入曲線方程，計(jì)算出供試品中可溶性多糖的含量，結(jié)果為8.56%。

3 討論

葸酮一硫酸法，其原理是糖類遇硫酸后脫水生成糖醛或其衍生物，再與蒽酮試劑發(fā)生縮合反應(yīng)生成有綠色的絡(luò)合物，顏色的深淺與糖的含量有關(guān)^[2]。葸酮一硫酸法在顯色30min后，吸收值趨于穩(wěn)定，時(shí)間約2h，該法穩(wěn)定、可靠。但蒽酮試劑要新鮮配制，時(shí)間過長(zhǎng)，顯色后顏色加深，測(cè)定結(jié)果增大。采用過夜的蒽酮試劑，葡萄糖在500nm處也出現(xiàn)最大吸收，但在低濃度時(shí)，最大吸收峰不明顯，重現(xiàn)性差。

從測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，枇杷葉中可溶性多糖的含量較高，可回收提取利用，這有利于中藥資源的綜合利用，蒽酮-硫酸比色法可供枇杷葉中水溶液多糖的檢測(cè)提供參考方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江帆.枇杷葉中水溶性多糖的提取工藝研究[J].福建果樹，2005(4)：135.

[2] 張純.改良蒽酮比色法測(cè)定牛膝多糖的含量[J].中華臨床醫(yī)藥，2003，4(19)：17.

[3] 張志良.植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，1997：127.

(責(zé)任編輯：姜付平)