化學發光檢測技術在水產領域的應用

化學發光是物質在化學反應過程中伴隨的一種光輻射現象，通過特殊的檢測儀器可以捕捉到這種光強度，從而對化學反應中的一些物質進行定性或定量研究。化學發光檢測技術最先被應用于人類的免疫學檢測領域，近年來，隨著人們對水產動物機體免疫能力以及水產品安全的關注程度的提高，化學免疫發光技術越來越多的應用到水產動物免疫學研究及微量物質的免疫學定量定性檢測上來，研究的領域涉及水產動物免疫因子的測定及水產品或其飼料產品中違禁物質的檢驗檢測。相對于放射免疫分析法、Elisa分析法以及一些常規的免疫學研究方法，化學發光技術有其獨特的優勢，如靈敏度高、特異性強、精密度好、線性范圍寬、儀器設備簡單、方法穩定、快速等優點，并且可以和多種免疫學檢驗手段聯用，顯示出了良好的應用前景。

1常用的化學發光劑及其特性

化學發光一般分為兩個步驟——化學激發和發光，反應必須能夠提供足夠的激發能，發光體分子直接或間接吸收能量后躍遷成為激發態，當從激發態再回到基態時就會產生光輻射，用自動發光分析儀接收光信號，實現對反應參與物或是催化劑、抑制劑的測定。該過程中能量的最終接受者一般就是化學發光劑，主要起到了標記和信號放大的作用。水產免疫學研究常見的化學發光劑主要有以下兩種：

1.1魯米諾（luminol）

魯米諾的衍生物主要有異魯米諾、4-氨基已基-N-乙基異魯諾及 AHEI 和 ABEI 等。魯米諾在堿性條件下（pH=10）形成單價陰離子，然后在反應體系中的催化劑如Fe2+、Cu2+等的催化下，與活性氧發生氧化還原反應生成二價陰離子氨基肽酸鹽（APD），APD躍回基態發出波長最大為425nm的光，魯米諾及其是最早在CLIA中使用的一種常用的化學發光物質，也是目前檢測水產動物血細胞吞噬活性的主要發光劑。

1.2吖啶酯類

吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無須催化劑，且標記效率、發光效率均很高。吖啶酯可以通過其分子結構上特有的取代基團與抗原、抗體和DNA等生物大分子結構上的氨基、羧基或者磷酸基直接或間接作用，從而標記這些生物大分子，實現這些生物物質的化學發光分析，這類化合物在H2O2和OH-的存在下能迅速發生親電加成反應生成過氧化物，過氧化物經過渡態二氧乙烷酮分解成激發態的N-2甲基吖啶酮，N-2甲基吖啶酮在返回到基態發出約λ=430nm 的光子。吖啶酯類及其衍生物經常被用于酶聯免疫分析中，使用吖啶酯作為標記物發展了各種不同分析物的競爭式和非競爭式免疫分析方法。

另外，還有一些發光劑如光澤精、洛粉堿、過氧化草酸酯、蒽綠、署紅等在各種研究中也常使用，但是在水產領域應用還是很少。

2呼吸爆發活性的化學發光檢測

在魚類等低等和無脊椎動物中，由于沒有一套完善的特異性免疫機制，血細胞（或體腔細胞）在防御異物入侵機體的過程中反應極為活躍，這些免疫細胞在吞噬經調理的非己物質時發生一系列代謝變化，包括氧攝取的驟增、單磷酸己糖旁路的澈活，這一現象總稱為呼吸爆發，并通過產生活性氧（ROS）行使防御功能，包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）、單態氧（O21）和羥自由基（·OH），這些毒性氧化產物存在時間雖短暫，但可介導許多重要功能，包括調節花生四烯酸代謝、刺激吞噬、殺菌功能及免疫過程等，活性氧產生的強弱直接反映了血細胞殺菌機能的強弱。由于O2-等活性氧可與化學發光冷光劑魯米諾（1uminol，3氨基鄰苯二甲酰肼）反應，使其產物激發，當后者返回基態時向外發光，利用特殊的檢測儀器如液體閃爍技術儀等設備測量發光強弱來衡量呼吸爆發的程度，從而確定機體非特異性免疫能力的強弱。研究證明化學發光法是測定吞噬細胞呼吸爆發活性氧產生最有效的工具。目前該發光檢測技術已經應用到多種水產動物的非特異性免疫研究上來，張敏等（2006）以酵母多糖為吞噬底物，通過對魯米諾濃度、全血稀釋度和檢測溫度等條件的優化，建立了中華鱉全血呼吸爆發的化學發光檢測方法。而國內對于水產無脊椎動物血細胞（或體腔細胞）的吞噬發光研究于二十世紀90年代末期才迅速開展起來。張峰等（1999）率先用化學發光分析法研究鮑血細胞吞噬的化學發光反應與呼吸爆發時的殺菌活性之間的關系，證明了皺紋盤鮑血細胞吞噬時具有能夠釋放活性氧進行殺菌的功能。張劍城等（2004）利用化學發光技術比較了4 種多糖對皺紋盤鮑血細胞活性氧和血清凝集活力的影響。

另外，水中有害物質對水產動物非特異免疫性能產生抑制作用，尤其對血細胞的呼吸爆發影響較為顯著，可以利用化學發光技術偵測吞噬發光從而反應有害物質對水產動物的損害程度。張峰等（2004）用化學發光法在體外定量研究了對硫磷濃度對皺紋盤鮑（Haliotis discus Hannai）血細胞吞噬化學發光的影響，發現在硫磷濃度為20mg/ L以上時能抑制皺紋盤鮑血細胞吞噬過程中釋放活性氧殺菌的能力。張峰等（2005）利用化學發光法研究重金屬：Cr、Cd、Hg、Pb、Cu和Zn對皺紋盤鮑血細胞吞噬時活性氧產生的影響，結果表明不同種類和不同濃度的重金屬浸泡急性處理皺紋盤鮑血細胞都不同程度地抑制了血細胞吞噬時的化學發光。

與NBT法測定活性氧比較而言，化學發光法具有操作簡便、靈敏度高并且能夠實時反映吞噬過程中的活性氧的變化規律，是一種極具潛力的吞噬性能分析方法。

3化學發光免疫分析技術

化學發光技術與免疫學反應結合起來，用光反應表現被測的免疫成分濃度，即把高靈敏的光反應與特異性的免疫

學反應相結合的方法，稱為化學發光免疫分析技術（CLIA）。目前化學發光免疫分析主要包括三大類型：標記化學發光物質的化學發光免疫分析、標記熒光物質的熒光化學發光免疫分析和標記酶的化學發光酶聯免疫分析。

發光酶聯免疫分析起步較早，1977年Arakawa et al基于放射免疫分析的基本原理將發光物質或酶標記在抗原或抗體上，免疫反應結束后，加入氧化劑或酶底物而發光，通過測量發光強度，根據標準曲線測定待測物的濃度。但該法真正用于水產動物免疫學研究上不多，但已有研究表明它是一種很有潛力的方法手段，如張峰等（2007）采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體，過氧化氫和魯米諾為辣根過氧化物酶的底物，建立檢測無脊椎動物體液等免疫因子的化學發光免疫分析方法參數，確定了捕獲抗體包被最適濃度和HRP-IgC3、IgC4抗體復合物適宜稀釋度，并用此法測定了刺參補體類似物AjC3和AjC4的含量。各種各樣的魯米若和異魯米諾的衍生物已經用于蛋白質的化學發光標記，但是標記蛋白質的特異性活性相對較低，導致標記后化學發光常常降低。而且，發光反應需要催化，導致很高的化學發光的背景值和潛在的干擾因素，因此，影響了這項技術的靈敏度。最近的研究結果證明，以甲基吖啶酯標記抗體是較理想的發光物質。各種各樣的吖啶酯鹽類能夠在堿性過氧化氫存在的條件下激發產生化學發光，不需要催化劑催化，受外界干擾因素少，只需在堿性溶液中加入微量H2O2，就可發出很強的光信號。對這些試劑的濃度的調整可以最大化光子發射密度，而且能夠最優化化學發光反應速率。此外，吖啶酯作為標記物操作簡易，穩定性高，自然本底很低，標記蛋白后不降低發光信號的產生，是魯米諾的最佳替代發光劑。

化學發光免疫分析技術還應用在水產品的違禁藥品檢測上，其靈敏度要高于當前普遍采用的Elisa檢測和放射免疫分析法。鑒于顯色Elisa對水產品中的氯霉素（CAP）的檢測限為0.1μg/L，很難滿足檢測要求，胥傳來等（2005）建立的化學發光酶免疫檢測方法（CLEIA）檢測對蝦組織中殘留的CAP，檢測靈敏度可達到0.01μg/L，檢測范圍為0.03～23.7μg/L，可滿足CAP殘留的檢測要求。王立等（2007）建立了水產品中鏈霉素殘留的化學發光檢測方法，適用于測定經過前處理的水產樣品（蝦、鯽魚和牙鲆）中鏈霉素的殘留，檢出限為0.05μg/g。裴翠錦等（2006）在微流動注射芯片上設計了螺旋形流通池，并采用精確時間控制進樣方式，結合四環素（TC）對魯米諾-H2O2化學發光體系的抑制作用，建立了微流動注射芯片化學發光法測定魚蝦中四環素的新方法，檢出限為1.7×10-8g/mL。

4小結

化學發光技術已經運用到人類醫學領域的各個方面，而在水產動物上的應用還較少，國外對該技術的研究起步較早，熒光化學發光免疫分析已經運用到水產動物的細胞功能研究上，發光技術和生物學的結合使體外和體內持續檢測生物過程變得簡單（如基因表達，蛋白質－蛋白質相互間作用和疾病的進程）。而且，結合發光酶或某些在基因水平有生物特異結合位點的發光蛋白發展了超敏感和選擇性的生物分析工具，發光分析信號的高度可偵測性使得它非常適合于微小化的生物分析裝置（如微矩陣，微流設備和高密度的微孔板）以用于小量樣品體積的基因和蛋白的高通量篩選。然而應當看到，這些技術離在水產上的應用還有一段距離，化學發光還存在諸多的問題有待解決，未來的幾年中，需要對發光劑的選擇及檢測條件的建立做進一步研究。