在飼料中添加中草藥對黃顙魚性腺發(fā)育的影響

摘要：在以魚粉和豆餅為蛋白源的含粗蛋白量為42.0%的基礎(chǔ)飼料中，分別加入益母草、川芎（Ｆ1）、山藥、黨參（F2）、熟地、何首烏（F3）、枸杞、女貞子（F4）、淫羊霍、杜仲等（F5）中草藥，在流水網(wǎng)箱中飼養(yǎng)平均體重12.0g的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidracoRichardson），以不添加中草藥為對照（F0），研究了中草藥對2冬齡黃顙魚性腺發(fā)育的影響。

關(guān)鍵詞：中草藥；黃顙魚；性腺；發(fā)育

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）肉質(zhì)細(xì)嫩，無肌間刺，市場需求日益增加，養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大。但是，繁殖效率低而不穩(wěn)，苗種數(shù)量不足，制約了大面積養(yǎng)殖。利用激素等化學(xué)藥物能夠促進(jìn)黃顙魚的成熟和繁殖，但長期使用會降低種質(zhì)質(zhì)量，污染環(huán)境。許多中草藥中含有激素樣物質(zhì)，能促進(jìn)性腺發(fā)育，提高牲畜的繁育力、受孕率、產(chǎn)仔能力及產(chǎn)仔后母體的健康恢復(fù)，但這類中草藥在促進(jìn)魚類性腺發(fā)育中的作用很少報(bào)道，而對黃顙魚性腺成熟的影響目前還未見報(bào)道。根據(jù)中醫(yī)理論，我們在2冬齡黃顙魚飼料中添加了不同中草藥，養(yǎng)殖90d后，測定血液中性激素的含量、肌肉的化學(xué)組成和性腺發(fā)育，旨在篩選出能促進(jìn)黃顙魚性腺發(fā)育的中草藥，提高人工繁殖效率，豐富繁殖營養(yǎng)學(xué)內(nèi)容。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)魚

實(shí)驗(yàn)魚來自遼寧省燈塔市忠信淡水漁業(yè)有限公司，挑選規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的2冬齡魚540尾，雄魚平均體重為78.0g、雌魚平均體重為58.0g，用高錳酸鉀溶液消毒后，隨機(jī)分成6組，放入18個(gè)120cm×120cm×150cm的網(wǎng)箱中，投喂6種飼料，每組３個(gè)重復(fù)。網(wǎng)箱放在室外兩個(gè)6.0m×2.0m×1.2m的微流水池中。

1.2實(shí)驗(yàn)飼料

以魚粉、豆餅為蛋白源，加入等量的各種添加劑，配成粗蛋白含量為42.0%的基礎(chǔ)飼料（F0組），然后加入不同中草藥（2%）（表1）。中草藥購于大連新美羅大藥房，經(jīng)煎煮，紗布過濾，將藥液均勻噴灑在飼料上，烘干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)期間水溫變化在19.0～25.0℃之間，日投飼率為3.0%，每天在日出前和日落后分別投喂日投飼量的30%和70%，保持微流水，每3d換水一次，溶解氧保持在5.0 mg/L以上。在每種飼料中取出一定量的樣品，測定飼料的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分。實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)分別測量魚體化學(xué)組成、血液指標(biāo)和性腺組織學(xué)切片。性腺指數(shù)（%）= 性腺重量（g）/魚體重量（g）×100。

1.4血清生化分析

性激素用日本產(chǎn)的OlympusACS：180化學(xué)發(fā)光免疫儀測定。雌二醇和睪酮試劑盒分別來自沈陽鑫華醫(yī)療設(shè)備有限公司和美國Bayer公司。血脂用日本產(chǎn)OlympusAU 400血脂分析儀測定。

1.5魚體生化組成分析

實(shí)驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)從各網(wǎng)箱中隨機(jī)取魚5尾。將樣品在75℃下烘至恒重，測定水分含量；分別用凱式定氮法（總氮×6.25）、索氏抽提法（以乙醚為抽提液）和馬福爐中灼燒（550℃）5h來測定粗蛋白、粗脂肪和灰分含量；用改進(jìn)的Folich法和液相色譜提取來測定魚體肌肉中的脂質(zhì)和脂肪酸（中國國標(biāo)GB/TS.124-2003， HPLC，日本產(chǎn)Thermo Quest GC/MS 型）。

1.6消化酶活性測定

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別采用福林－酚試劑法、碘顯色法和馮俊榮等（2004）的方法測定。

1.7性腺的組織學(xué)觀察

結(jié)束時(shí)從各網(wǎng)箱中隨機(jī)取雌、雄魚各5尾。摘取性腺置Bouin氏液中固定24h后，移入70%的乙醇中保存。各級乙醇沖洗、脫水，經(jīng)二甲苯透明，石蠟包埋，制成厚5～8μm的切片，H.E.染色，中性膠封片后置顯微鏡下觀察、拍照。每個(gè)切片觀察10個(gè)卵細(xì)胞或壺腹。

1.8數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)、方差分析和LSD多重比較。以p<0.01為差異極其顯著，p<0.05為差異顯

著。

2結(jié)果

2.1中草藥對黃顙魚性腺指數(shù)和性細(xì)胞發(fā)育的影響

90d的飼養(yǎng)表明，F(xiàn)4組雌魚的性腺指數(shù)（2.085%）最高，分別極顯著地（P<0.01）高于F0（1.206%）組魚的72.89%、F2（1.351%）的54.33%、F3（1.332%）的56.53%，與其它各組魚差異不顯著（P>0.05）（圖1）。

黃顙魚攝食含有中草藥的飼料后，F(xiàn)4（0.6502%）和F5（0.6521%）組雄魚的性腺指數(shù)顯著（P<0.05）高于F3組魚（0.4606%）的41.80%，與其它各組魚差異不顯著（P>0.05）。

組織學(xué)觀察表明，攝食含不同中草藥飼料的雄魚精巢每個(gè)視野中的平均壺腹數(shù)差異不顯著（P>0.05）（表2）（圖版7-12）。但F4和F1組雌魚卵徑分別極顯著（P<0.01）和顯著（P<0.05）的高于其它各組，而其它各組間差異性不顯著（P>0.05）（圖版1-6）。F4組魚卵巢卵母細(xì)胞的核徑與其它各組差異極顯著（P<0.01），F(xiàn)0組與F2、F5組差異不顯著（P>0.05），與其它各組差異顯著（P<0.05）。攝食含不同中草藥飼料的雌魚卵徑、核徑之比差異不顯著（P>0.05），但F4和F5組魚卵巢每個(gè)視野的平均卵粒數(shù)與其它各組間差異極顯著（P<0.01）。

2.2不同中草藥對黃顙魚腸道酶活性的影響

方差分析表明，F(xiàn)2組雄黃顙魚腸道脂肪酶活性最高，與F0、F1、F4、F5組魚差異極顯著（P<0.01），與F3組差異顯著（P<0.05），其它各組間差異不顯著（P>0.05）（表3）；F3組魚蛋白酶活性最高，與F1、F5組差異極顯著（P<0.01），與F0、F4組差異顯著（P<0.05），與F2組差異不顯著（P>0.05），其他各組間差異不顯著。各組間淀粉酶活性差異不顯著（P>0.05）。

F5組雌魚腸道脂肪酶活性最高，與F0、F1、F2和F3組差異極顯著（P<0.01），與F4組差異顯著（P<0.05）；F4組低于F5組，而高于其它各組，與F0、F2、F3組差異極顯著（P<0.01），與F1組差異顯著（P<0.05）（表3）。F4、F5組魚腸蛋白酶活性差異不顯著（P>0.05），與其它各組差異顯著（P<0.05）；淀粉酶活性差異不顯著（P>0.05）。上述結(jié)果表明，性腺指數(shù)高時(shí)，脂肪酶和蛋白酶的活性較高，即促進(jìn)性腺發(fā)育的中草藥能提高脂肪酶和蛋白酶的活性，而腸淀粉酶則沒有這種相關(guān)性。

2.3中草藥對黃顙魚肌肉生化組成的影響

方差分析表明，F(xiàn)4組雄黃顙魚肌肉中粗蛋白含量最低，與其它各組差異極顯著（P<0.01）（表4）；F2組魚肌肉中粗脂肪含量與F0、F1組差異極顯著（P<0.01），與F3、F4和F5組差異顯著（P<0.05），其它各組差異不顯著（P>0.05）；F3組魚灰分含量最低，與F0、F4組差異極顯著（P<0.01），與F2、F5組差異顯著（P<0.05）。這表明雄魚性腺指數(shù)高時(shí)，肌肉中蛋白質(zhì)含量降低，而脂肪和灰分含量沒有顯著變化。

F4組雌黃顙魚肌肉中粗蛋白含量最低，與較高的F0組和F3組差異極顯著（P<0.01），與F2組差異顯著（P<0.05），其它各組差異不顯著（P>0.05）（表4）；而F4組魚粗脂肪含量則最高，與其它各組差異極顯著（P<0.01），F(xiàn)0組與F1、F3、F5組差異極顯著（P<0.01），與F2組差異顯著（P<0.05）；F4組魚肌肉中灰分含量最低，與其它各組差異極顯著（P<0.01）。這些結(jié)果表明，雌魚性腺指數(shù)高時(shí)，肌肉中蛋白質(zhì)和灰分含量降低，而脂肪含量增高。

攝食含中草藥飼料的F5、F4、F3、F2和F1組雄魚肌肉中飽和脂肪酸（SFA）含量分別比對照組魚高25.73%、12.63%、21.36%、13.40%和28.92%；單不飽和脂肪酸（MUFA）含量分別高17.35%、21.00%、38.37%、 9.381%和11.08%（表5）；但肌肉中n-3系列脂肪酸的含量卻比對照魚低22.38%～29.88%；F1、F2、F3和F5組魚n-6系列脂肪酸含量分別比對照魚高32.27%、6.21%、10.46%和10.03%，但F4組魚卻比對照魚低3.40%。F1和F3組魚肌肉中多不飽和脂肪酸（UFA）含量與對照魚差異不顯著（P>0.05），其它各組低于對照魚。

攝食含中草藥飼料的雌魚肌肉中SFA和MUFA含量的變化趨勢與雄魚相似：均高于對照魚，但高的幅度更大，肌肉中n-3系列脂肪酸的含量卻低于對照魚（表6）。F5、F4、F3、F2和F1組雌魚肌肉中SFA含量分別比對照組魚高169.7%、135.5%、135.7%、145.9%和175.4%；單不飽和（MUFA）含量分別高119.5%，170.3%、139.2%、145.4%和76.3%；肌肉中n-6系列脂肪酸含量高35.8%、45.2%、15.5%、20.6%和30.5%；UFA含量高8.4%、12.6%、6.3%、12.5%和6.8%，但肌肉中n-3系列脂肪酸的含量卻比對照魚低35.4%、48.0%、40.0%、33.6%和22.3%。

2.4中草藥對黃顙魚血清指標(biāo)的影響

F1、F3、F4組雄魚血清中甘油三脂含量分別比對照魚高48.94%、40.78%和56.74%（表7），F(xiàn)5組下降了42.91%；F2和F5組總膽固醇含量分別比對照魚下降了14.04%和48.29%，F(xiàn)3和F4組魚分別上升了3.70%和0.76%；各組魚高密度脂蛋白含量下降了55.79%～60.00%；F1、F2和F4組魚低密度脂蛋白含量分別比對照魚下降了28.00%、32.00%和22.00%；各組睪酮含量下降79.22%～87.69%。雌魚血清中甘油三脂、總膽固醇和雌二醇含量的變化趨勢與雄魚相似：前兩者均有較大幅度上升，后者降低，但高、低密度脂蛋白含量卻相似和升高（表7）。

表7黃顙魚攝食添加中草藥飼料時(shí)的血清指標(biāo)

3討論

枸杞子富含甜菜堿和紅蘿卜素等多種維生素，可提高cAMP/cGMP比值，促進(jìn)蛋雞的生產(chǎn)性能。女貞子含有女貞子苷等多種苷類，具有抗菌、消炎作用，與枸杞子等配伍能顯著提高蛋重和產(chǎn)蛋率。性腺指數(shù)是評價(jià)性腺發(fā)育程度的主要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)4組性腺指數(shù)、卵徑、核徑明顯高于其它組，說明F4組中草藥即枸杞、女貞子等能顯著促進(jìn)黃顙魚的性腺發(fā)育。

魚類卵巢生長需儲存大量的蛋白和脂肪。這些物質(zhì)歸根結(jié)底來自飼料。飼料中的蛋白質(zhì)和脂類經(jīng)過腸道分解吸收后，通過血液中的載脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至卵巢中。各實(shí)驗(yàn)飼料的蛋白和脂肪含量相近，但F4組雌魚腸道脂肪酶和蛋白酶活性較高，表明中草藥通過增加酶活性促進(jìn)機(jī)體對飼料中蛋白質(zhì)和脂肪的吸收。脂肪不溶于水，在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)需要載體。高密度脂蛋白和低密度脂蛋白作為載體在體內(nèi)協(xié)助脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)。F4組雌、雄魚肌肉中粗蛋白和灰分含量低，表明這兩種成分都是性腺發(fā)育所必需的營養(yǎng)成分，但F4組雌魚肌肉中粗脂肪和血脂含量較高，說明卵子發(fā)育不僅需要蛋白質(zhì)，還需要脂類等能量物質(zhì)，枸杞、女貞子等中草藥可促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪的消化、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存。在脂類轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，卵巢對各種脂肪酸的需求有所不同，據(jù)報(bào)道，魚類在繁殖期間，對n-3系列不飽和脂肪酸的需要量大于對n-6系列不飽和脂肪酸的需要量，尤其是雌魚。雌魚肌肉中n-3系列脂肪酸含量顯著少于對照魚，說明添加中草藥促進(jìn)了脂肪在黃顙魚雌魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)了n-3系列不飽和脂肪酸由肌肉向卵巢內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和積累。

脂類被吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至性腺后，F(xiàn)4組的中草藥促進(jìn)了卵粒對脂肪的吸收和積累，增加了性腺重。但在性腺切片中，性腺發(fā)育較快的Ⅲ期卵母細(xì)胞膜卻呈萎縮現(xiàn)象（圖版1-6）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)為9月中旬，可能正值親魚對性腺的“重吸收”期。這與對養(yǎng)殖鰣（Tenualosa reevesii）和東海寬體舌鰨（Cynoglossus robustus） 卵巢周年變化的組織學(xué)觀察相似。“重吸收”之后肌肉中的脂肪含量又會升高，作為第二年春天性腺發(fā)育的能量來源之一。Lourdes和Carlos（1997）對西班牙河流魚類資源的周年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，親魚在3～4月繁殖季節(jié)，肌肉中能量含量達(dá)到第一個(gè)高峰，隨后降低，在6月份降到最低點(diǎn)，10～11月又重新達(dá)高峰。在此期間肌肉中的能量含量和性腺的能量含量都在處于上升階段，但肌肉中能量上升的趨勢較性腺中的更顯著。本實(shí)驗(yàn)中，雌魚通過增加肌肉中的脂肪含量和積累，為春天性腺迅速發(fā)育和增重做好了脂類儲備。F4組魚肌肉中粗脂肪含量高，說明中草藥根據(jù)魚體的生理需要促進(jìn)了脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)。

本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)4組魚血液中雌二醇或睪酮含量低于對照魚，這可能與性激素與靶器官的結(jié)合有關(guān)。雌二醇和睪酮屬甾類激素，分子小，脂溶性，擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)，與胞漿內(nèi)特殊的蛋白質(zhì)—受體蛋白結(jié)合后，使受體的構(gòu)型改變，形成激素—受體蛋白復(fù)合物，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮第二信使作用，所以血液中雌二醇或睪酮含量低。這與花尾胡椒鯛（Plectrogenlum nanum）在8～9月份血液中性激素含量下降相似。添加中草藥可能促進(jìn)了性激素與靶器官的結(jié)合，導(dǎo)致血液中性激素含量下降。

上述分析表明，黃顙魚攝入含中草藥飼料后，提高了腸道的脂肪酶和蛋白酶活性，促進(jìn)了對營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，血脂含量升高，脂類的轉(zhuǎn)運(yùn)和營養(yǎng)積累增加，增強(qiáng)了性激素與靶器官的結(jié)合，使血液性激素含量降低，卵徑增大，性腺指數(shù)升高。