全硫代反義寡核苷酸抑制人膀胱癌Ｅｊ細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】 目的 研究全硫代反義寡核苷酸（PSASODN）對(duì)人膀胱癌細(xì)胞Ej端粒酶活性及細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，探討PSASODN在膀胱癌治療中的價(jià)值，為臨床治療膀胱癌提供理論依據(jù)。方法 將PSASODN 轉(zhuǎn)染作用于人膀胱癌細(xì)胞Ej中，分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附( ELISA) 法檢測(cè)不同濃度PSASODN對(duì)人膀胱癌細(xì)胞Ej的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和端粒酶活性的作用。結(jié)果 PSASODN作用于人膀胱癌細(xì)胞Ej后能顯著抑制人膀胱癌細(xì)胞Ej的端粒酶活性，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且呈現(xiàn)時(shí)間特異性和劑量依賴(lài)性，與SODN 轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組進(jìn)行比較，差異顯著(P＜0.05或0.01)。結(jié)論 PSASODN能抑制人膀胱癌細(xì)胞Ej的生長(zhǎng)，降低其端粒酶活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制端粒酶活性可能成為膀胱癌基因治療的新靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 全硫代反義寡核苷酸；膀胱癌；端粒酶

文章編號(hào)：1003-1383(2008)02-0130-03中圖分類(lèi)號(hào)：R 737.14文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Inhibitory effects of the proliferation of human bladder carcinomaEj cell by antisense phosphorothioate oligonucleotide [HJ1*2]

GUO Wei1，CHEN Meini2，F(xiàn)ENG Jizhou1

(1. Department of urinary surgery， affiliated hospital of Yan'an University， Yan'an， 716000；2. Medical college of Yan'an University， Yan'an， 716000)

【Abstract】 Objective To study the effects of antisense phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (PSASODN) on telomerase activity and proliferation of bladder carcinoma Ej cell， and explore the treatment value of PSASODN for bladder cancer.

Methods PSASODN was transfected into bladder cancer cell line Ej by liposomal transfection. Effects of different PSASODN density on proliferation activity of cell proliferation， cell withering， activity of telomerase of Ej were examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)， flow cytometermethod and ELISA.Results Telomerase activity of Ej cells， transfected with PSASODN， was significantly inhibited， compared with that of control groups and nonsense oligonucleotide (SODN) transfected cells (P＜0.05 or 0.01)，and showed no difference between the latter two groups (P＞0.05). Inhibitory effect of PSASODN was showed in a dose and timedepended manner. The proliferation of Ej cells transfected with ASODN undergoing apoptosis was statistically lower than that of control groups (P＜0.05).

Conclusion PSASODN can inhibit the growth of Ej Cells and decrease telomerase activity， causing the revulsion of cell withering. The results suggested that inhibition of telomerase activity would be a new target to treatment for bladder cancer.

【Key words】 antisense phosphorothioate oligonucleotide；bladder cancer; telomerase 

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。端粒酶抑制劑能夠抑制端粒酶的活性，使腫瘤細(xì)胞完全失去增殖能力，趨于分化和凋亡，成為研究熱點(diǎn)之一。本文擬通過(guò)觀察針對(duì)端粒酶模板設(shè)計(jì)的全硫代反義寡核苷酸(PSASODN) 對(duì)人膀胱癌Ej細(xì)胞端粒酶活性的影響，為膀胱腫瘤基因治療臨床應(yīng)用提供新的基因靶點(diǎn)。

材料與方法

1.材料 人膀胱癌細(xì)胞株Ej(上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(SIGMA公司)； PSASODN序列為5’CTCAGTTAGGGTTAGACA-3’，PSSODN序列為5’CATTTCTTGCTCTCCACG3’，均為全硫代修飾型(上海生工生物工程公司)；脂質(zhì)體(Beyotime Biotechnology公司)；半定量端粒酶檢測(cè)試劑盒(大連泛邦生物公司)；離心機(jī)(上海安亭儀器廠(chǎng))；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司)； Biocellhtl型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(南京華東公司)。

2.方法(1)細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞Ej以5×104/ml密度接種在含10%新鮮胎牛血清、100 U/ml慶大霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO₂孵箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 脂質(zhì)體介導(dǎo)的全硫代反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染按說(shuō)明書(shū)操作。實(shí)驗(yàn)分5組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。5組分別為

終濃度為5 μmol/L，3 μmol/L 及1 μmol/L 的ASODN組，終濃度為 5 μmol/L的SODN組以及正常對(duì)照組(僅加培養(yǎng)液)。用藥后將小牛血清的濃度調(diào)至5%，以減少寡聚脫氧核苷酸的降解。24 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)液，并繼續(xù)培養(yǎng)，收集細(xì)胞備用。

(3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 細(xì)胞以5×104 /ml密度接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μl，待細(xì)胞生長(zhǎng)活躍時(shí)加處理因素，分組同細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后檢測(cè)。檢測(cè)方法：每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，翻板倒掉液體，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μl，輕輕振蕩10 min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)540 nm處的吸光度(OD) 值。計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率（％）＝(空白對(duì)照組平均OD值-PSASODN組平均OD值)/空白對(duì)照組平均OD值。

(4)端粒酶活性檢測(cè) 取處理因素作用24 h、48 h、72 h后的細(xì)胞104個(gè)，PBS洗滌后離心去上清，加裂解液10 μl，冰浴放置30 min，4℃、15000 rpm 離心10 min，取上清液保存于-80℃，以備端粒酶活性檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)每組在450 nm處的OD值，并計(jì)算相應(yīng)的端粒酶活性。Index=樣品的OD值/ 標(biāo)準(zhǔn)液的OD值。結(jié)果判斷:Index≥1為+；Index在0.91～0.99為+/-；Index≤0.90為-。

(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè) 取處理因素作用24 h、48 h、72 h后的細(xì)胞10⁶個(gè)，70%酒精固定24 h，冷PBS洗滌3次，15000 rpm離心10 min，棄上清，碘化丙啶避光染色30 min，上機(jī)測(cè)試細(xì)胞凋亡。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以-±s表示，用SPSS 11.5軟件包處理，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)。

結(jié)果

1.MTT檢測(cè)結(jié)果 5 μmol/L，3 μmol/L及1 μmol/L的PSASODN 轉(zhuǎn)染Ej細(xì)胞后24 h，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制，與對(duì)照組比較(P＞0.05)；48 h能夠抑制細(xì)胞增殖，與對(duì)照組比較(P＜0.05)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系；72 h與對(duì)照組比較能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖 (P＜0.01)，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。表明對(duì)Ej細(xì)胞活性的影響在48 h左右開(kāi)始起作用，呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性(表1)。

2.PSASODN對(duì)膀胱癌細(xì)胞Ej端粒酶活性的影響 作用24 h、48 h的各組細(xì)胞端粒酶活性均為陽(yáng)性。72 h檢測(cè)結(jié)果表明：5 μmol/L的SODN轉(zhuǎn)染的Ej細(xì)胞端粒酶仍表現(xiàn)為陽(yáng)性；ASODN轉(zhuǎn)染Ej細(xì)胞后，端粒酶活性顯著降低，呈劑量依賴(lài)性(表2)。

討論

端粒酶是控制腫瘤細(xì)胞增生及凋亡的重要調(diào)控物質(zhì)之一［1］，高活性的端粒酶是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的必需條件之一，而在多數(shù)正常的體細(xì)胞中卻缺乏活性，因此抗端粒酶療法具有特異性高，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，逐漸成為治療腫瘤的熱點(diǎn)［2，3］。全硫代修飾的反義核酸溶解性好，不易被核酸降解，半衰期長(zhǎng)，作用持久的特點(diǎn)，更適于臨床應(yīng)用［4］。脂質(zhì)體為非毒性載體，無(wú)插入突變危險(xiǎn)，將核酸導(dǎo)入細(xì)胞后即被降解，無(wú)毒物免疫原性，效率高，特異性強(qiáng)，具有良好的應(yīng)用前景［5］。

研究表明，用反義hTR轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，端粒酶活性明顯降低，端粒縮短［6］。國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究也證實(shí)端粒酶反義核酸能抑制多種癌細(xì)胞的端粒酶活性［7～9］。該點(diǎn)在本研究中同樣得到證實(shí)，人膀胱癌細(xì)胞Ej細(xì)胞經(jīng)端粒酶PSASODN作用后，端粒酶活性受到抑制，而PSSODN對(duì)人膀胱癌細(xì)胞Ej細(xì)胞的端粒酶無(wú)抑制作用，提示PSASODN對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用是序列特異性的，這種作用表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。端粒酶活性與細(xì)胞增殖有關(guān)［10］，而且這種端粒酶活性抑制所誘導(dǎo)的凋亡是p53非依賴(lài)的，可能是端粒酶活性抑制后影響到染色體的穩(wěn)定性，由此激發(fā)某種非p53依賴(lài)的信號(hào)系統(tǒng)從而誘導(dǎo)了凋亡［11，12］。caspase家族也可能參與了端粒酶RNA組分的反義寡核苷酸所誘導(dǎo)的凋亡［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示PSASODN轉(zhuǎn)染人膀胱癌細(xì)胞Ej細(xì)胞后，不僅端粒酶活性下降，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，凋亡明顯，而且呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。

本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用PSASODN治療膀胱癌提供了理論依據(jù)。但是端粒酶抑制劑對(duì)生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等端粒酶表達(dá)陽(yáng)性的正常細(xì)胞也可能產(chǎn)生毒副作用。因此，此療法應(yīng)用于膀胱癌的臨床治療尚需進(jìn)一步的研究和探索。

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(收稿日期：2008-02-13 修回日期：2008-04-12)

(編輯：梁明佩 英文審校：唐雄林)

注：本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文。