鏈霉菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｚ９２發酵液的抗真菌譜及穩定性

(1．沈陽農業大學植物保護學院，沈陽110161；2．黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱150080)

摘要：研究了鏈霉菌Streptomyces tz92發酵液的抗真菌譜及穩定性#65377;結果表明，菌株Streptomyces tz92發酵液對水稻紋枯病菌#65380;番茄灰霉病菌等31種植物病原真菌的抑菌圈直徑在20 mm以上，其中對水稻紋枯病菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達52．45 mm；發酵液中的抗菌物質對溫度變化#65380;光照#65380;紫外光以及在堿性條件下都比較穩定，但在強酸環境中不穩定；菌株Streptomyces tz92連續傳接10代，抑菌活性仍然穩定#65377;

關鍵詞：鏈霉菌Streptomyces tz92；發酵液；抗真菌譜；穩定性

中圖分類號：S482．2+92文獻標識碼：B文章編號：0439－8114(2008)06－0671－03

Antifungal Spectrum and Stability of Fermentation Broth of the Strain Streptomyces tz92

JIANG Xiao－fan1，SONG Ying1，ZHAO Xiu－xiang1，DU Chun－mei2，WU Yuan－hua1

(1．Plant Protection College， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China；

2．College of Life Science， Heilongjiang University， Haerbin 150080， China)

Abstract： The antifungal spectrum and stability of fermentation broth of the strain Streptomyces tz92 were studied． The inhibition diameters of the fermentation broth to 31 phytopathogenic fungi， such as Rhizoctonia solani， Botrytis cinerea etc．， were up to 20mm， among which， the inhibition diameter against Rhizoctonia solani was the highest， 52．45mm．The stability of the fermentation broth were tested． The results showed that the antimicrobial substance in the fermentation broth was stable to temperature， light， ultraviolet and alkali，while it is unstable in extreme acid condition． When the strain Streptomyces tz92 was transferred for 10 _generations，the activity of itsfermentation broth was also stable．

Key words： Streptomyces tz92； fermentation broth； antifungal spectrum； stability

不吸水鏈霉菌遼寧變種(Streptomyces ahygroscopicus var．liaoningensis，編號Streptomyces tz92)，是從沈陽天柱山的土壤中分離得到的一株鏈霉菌，是沈陽農業大學植物病毒研究室研制開發的新一代農用抗病毒抗生素嘧肽霉素的產生菌#65377;嘧肽霉素已獲準農藥臨時登記，登記作物為番茄和煙草#65377;該抗生素對煙草花葉病毒病#65380;番茄病毒病等多種植物病毒病均有明顯的防效[1－5]#65377;同時，應用過程中發現該抗生素不僅對植物病毒病有很好的防效，而且對許多植物真菌病害也有很好的防治作用[6－7]#65377;本文研究了菌株Streptomyces tz92發酵液的抗真菌譜及發酵液中抗菌物質的穩定性，以便為菌株Streptomyces tz92的進一步開發利用提供理論和實踐基礎，并為該菌株發酵液中抗真菌組分的分離純化#65380;結構測定及加工儲藏等提供理論參考#65377;

1材料與方法

1．1材料

1．1．1供試菌株菌株Streptomyces tz92，供試病菌為水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)等31種植物病原真菌，指示菌為煙草赤星病菌(Alternaria alternata)#65377;以上菌種均由本研究室分離保存#65377;

1．1．2培養基斜面和平板培養基：PDA培養基(馬鈴薯200 _g，葡萄糖20 _g，瓊脂粉15 _g，蒸餾水

1 000 mL，pH值自然)#65377;高氏麥麩培養基：麩皮10 _g，可溶性淀粉13．3 _g，葡萄糖6．7 _g，NaCl 0．5 _g，MgSO40．5 _g，KNO3 1g，K2HPO4 0．5 _g，FeSO4 0．005 _g，瓊脂粉25 _g，pH值7．0～7．2#65377;發酵培養基：可溶性淀粉47 _g，花生餅粉22 _g，酵母粉2 _g，(NH4)2SO4 2．7 _g，NaCl 2．7 _g， CaCO3 2．7 _g，pH值7．2#65377;所有培養基在0．1Mpa下滅菌30 min備用#65377;

1．2方法

1．2．1發酵液制備在無菌條件下，用無菌水制成菌株Streptomyces tz92孢子懸浮液，高氏麥麩培養基上每皿加入0．5 mL菌懸液，無菌鏟刮均勻，置于28℃恒溫培養箱中培養4 d，待菌落表面顏色變為深灰色后表明大部分孢子已成熟，即可用于發酵#65377;在無菌條件下直接將帶菌種的培養基分割裝入加有定量液體培養基的三角瓶中，用透氣封口膜封口，置于28℃#65380;140 r·min^－1的條件下振蕩培養96 h，用紗布濾除菌絲體，再在4 000r·min^－1常溫條件下離心15 min，收集上清液備用#65377;

1．2．2杯碟法測定發酵液抗真菌譜先在培養皿中倒入10 mL瓊脂培養基，凝固后再加入10 mL含有各病原菌孢子或菌絲懸液的培養基，待凝固后在每個培養皿上輕輕放置1個滅菌牛津杯，每個牛津杯中加入200 μL發酵液，每個處理重復3次，置于28℃恒溫培養箱中培養48～96 h后測量抑菌圈直徑，取平均值[8]#65377;

1．2．3發酵液中抑菌物質穩定性的測定

1)溫度穩定性#65377;將發酵液進行以下兩種處理：①將發酵液于50#65380;60#65380;70#65380;80#65380;90#65380;100#65380;121℃下分別處理0．5#65380;1#65380;1．5#65380;2#65380;2．5#65380;3 h，以煙草赤星病菌作為指示菌，未處理發酵液作為對照，杯碟法測定其抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑變化情況來確定其熱穩定性，每個處理重復3次#65377;②取4份發酵液，每份2 mL，裝入封口離心管中，分別放在－20#65380;4#65380;28#65380;55℃恒溫條件下保存30 d，杯碟法測定其抑菌圈直徑，每個處理重復3次#65377;

2)酸堿穩定性#65377;取10份發酵液，每份2 mL，分別用1 mol·L^－1 HCl#65380;1 mol·L^－1 NaOH將樣品分別調成pH值1～10，以煙草赤星病菌作為指示菌，未處理發酵液作為對照，杯碟法測定其抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑變化情況來確定其酸堿穩定性，每個處理重復3次#65377;

3)光穩定性#65377;將發酵液置于4 000lux的光照箱中分別照射2#65380;4#65380;6#65380;8#65380;10#65380;12 h，以煙草赤星病菌作為指示菌，未處理發酵液作為對照，杯碟法測定其抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑變化情況來確定其光穩定性，每個處理重復3次#65377;

4)UV穩定性#65377;15 w紫外燈下，距離20 cm處，將發酵液放在紫外線下照射0．5#65380;1#65380;1．5#65380;2#65380;2．5#65380;3 h，以煙草赤星病菌作為指示菌，未處理發酵液作為對照，杯碟法測定其抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑變化情況來確定其UV穩定性，每個處理重復3次#65377;

1．2．4菌株的傳代穩定性將菌株Streptomyces tz92在高氏麥麩培養基上每隔兩天傳代1次，連續傳10代，然后測定各代菌株發酵液對煙草赤星病菌的抑菌活性，每個處理重復3次#65377;

2結果與分析

2．1發酵液的抗真菌譜

菌株Streptomyces tz92的發酵液對多種植物病原真菌都有較好的抑菌活性，表明其抑菌譜較廣(表1)，對31種植物病原真菌的抑菌圈直徑均達20 mm以上#65377;

2．2發酵液中抑菌物質的穩定性

2．2．1溫度穩定性將發酵液在50#65380;60#65380;70#65380;80#65380;90#65380;100#65380;121℃下分別處理0．5#65380;1#65380;1．5#65380;2#65380;2．5#65380;3 h，結果表明，只有在121℃下處理后活性明顯下降，其他溫度處理后其抑菌活性基本沒有變化(表2)，說明發酵液所產生的抑菌物質具有較強的熱穩定性#65377;

將發酵液分別放在－20#65380;4#65380;28#65380;50℃恒溫條件下保存30 d，結果表明，發酵液在4℃條件下保存效果最好，而在其他溫度條件下保存抑菌活性略有下降#65377;

2．2．2酸堿穩定性發酵液在pH值4～10條件下抑菌活性基本不變，在pH值1～3條件下抑菌活性明顯降低(圖1)，發酵液所產生的抑菌物質在強酸條件下穩定性差#65377;因此，對發酵液中活性物質進行分離純化時應保持中性或堿性條件下進行#65377;

2．2．3光穩定性發酵液置于4 000lux的光照箱分別照射2#65380;4#65380;6#65380;8#65380;10#65380;12 h后抑菌活性基本不變，表明發酵液的光穩定性較好#65377;

2．2．4UV穩定性發酵液經紫外光分別照射0．5#65380;1#65380;1．5#65380;2#65380;2．5#65380;3 h后抑菌活性基本不變，表明發酵液的UV穩定性較好#65377;

2．3菌株的傳代穩定性

將菌株Streptomyces tz92連續培養10代，其發酵液對煙草赤星病菌的抑菌活性沒有明顯變化，表明該菌株有較好的傳代穩定性#65377;

3結論與討論

本文測定結果進一步明確了菌株Streptomyces tz92發酵液所產生的活性物質具有明顯的抗真菌活性，對引起根部#65380;葉部和苗期病害等31種病原真菌均有較好的拮抗作用#65377;穩定性研究表明，發酵液殺真菌活性成分對溫度#65380;光照#65380;紫外光和強堿均具有良好的穩定性，且菌株Streptomyces tz92傳代穩定性較好，顯示出該菌株在防治真菌病害方面具有可開發利用的價值#65377;同時，本文也為該菌株殺真菌有效組分的分離純化提供了理論依據#65377;

在農用抗生素中，兼殺真菌和抗病毒的抗生素曾有報道，如井岡霉素是防治水稻紋枯病高效#65380;低毒的理想生物農藥，現研究又發現井岡霉素具有一定誘導植株產生系統抗病毒的作用[9^－10]#65377;寧南霉素不僅適用于防治煙草#65380;番茄等多種作物的病毒病，并且可以兼防白粉病#65380;根腐病#65380;炭疽病等真菌性病害[11^－12]#65377;本文報道的菌株Streptomyces tz92是農用抗病毒抗生素嘧肽霉素的產生菌，嘧肽霉素是通過有選擇性地抑制病毒RNA的復制和蛋白質的合成起到抗病毒作用[2，5]，但其抗真菌活性物質的結構#65380;作用機理還不清楚，因此有必要明確其產生的抗真菌活性物質的分離純化技術進而明確其結構#65377;

參考文獻：

[1]吳元華，杜春梅，朱春玉，等．新型農抗嘧肽霉素研究進展[J]．云南農業大學學報，2003，18(4)：135^－136．

[2]吳元華，朱春玉，杜春梅，等．嘧肽霉素影響煙草花葉病毒RNA蓄積量的研究[J]．病毒學報，2005，21(4)：311－313．

[3]趙秀香，吳元華，杜春梅，等．新型農藥嘧肽霉素防治番茄病毒病藥效[J]．農藥，2004，43(12)：534－536．

[4]王艷紅，吳元華，朱春玉，等．嘧肽霉素又一抗病毒活性成分的研究[J]．沈陽農業大學學報，2006，37(1)：44－47．

[5]朱春玉，吳元華，趙秀香，等．嘧肽霉素抗煙草花葉病毒作用機理初步研究[J]．植物病理學報，2006，36(4)：52－54．

[6]宋 影．嘧肽霉素對植物真菌病害的防效及作用機理研究 [D]．沈陽：沈陽農業大學圖書館，2003．

[7]毛竹，吳元華，趙秀香．6%嘧肽菌凈水劑防治黃瓜白粉病藥效試驗[J]．農藥，2007，46(2)：135^－137．

[8]方中達．植病研究方法[M]．北京：中國農業出版社，1998．248－249．

[9]張穗，郭永霞，唐文華，等．井岡霉素A對水稻紋枯病菌的毒力和作用機理研究[J]．農藥學學報，2001，3(4)：31－37．

[10]張穗，唐文華，談文．井岡霉素A處理珊西煙后對TMV枯斑數目和抗性相關酶的影響[J]．中國煙草學報，2002，8(4)：38－40．

[11]趙秀榆．寧南霉素防治菜豌豆白粉病[J]．農藥，2000，39(4)：41．

[12]劉彥良，劉峰，慕衛，等．寧南霉素和多抗霉素對黃瓜白粉病的控制作用研究[J]．農藥科學與管理，2005，26(5)：18－22．