大孔樹脂Ｄ－１０１、Ｘ－５、ＡＢ－８對烏頭總堿的純化工藝

(西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽621000)

摘要：選擇最佳的分離純化附子總生物堿工藝，以總生物堿的提取率為指標，比較確定高效的粗提條件和優化的樹脂純化工藝#65377;確定了最佳粗提條件和最佳吸附樹脂X－5#65380;AB－8#65380;D^－101的洗脫#65380;吸附條件#65377;X－5#65380;AB－8#65380;D^－101可用于工業化烏頭總堿的提取#65377;

關鍵詞：D^－101#65380;X－5#65380;AB－8樹脂；烏頭總堿；純化

中圖分類號：S567．23+9；R284．3 文獻標識碼：A 文章編號：0439－8114(2008)06－0711－04

Extraction and Purification of Total Alkaloids from Aconitum carmichaeli by D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 Macroreticular Resin

WAN Li－xiang，YANG Xiao－sheng，HOU Da－bin

(College of Life Science and engineering South－western University of Science and Technology，Mianyang 621000，Sichan，China)

Abstract：This paper studied the optimum methods of extracting and refining total alkaloidals from Acontum carmichaeli． Taking extraction percentage of total alkaloidals as index， the optimum primary extracting and purity of macroreticular resin methods was selected． The optimum primary extracting， and optimum elution and absorption of D^－101#65380;X－5#65380;AB－8macroreticular resin were determined．

Key words： D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 macroreticular resin；total alkaloidals；purification

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx．)的側根[1]，為常用中藥，有毒，具有祛風除濕#65380;溫經止痛功效，臨床上主要用于治療風濕#65380;類風濕#65380;關節炎等癥#65377;附子發揮藥效的主要成分為其所含的生物堿類物質#65377;烏頭總堿具有明顯的鎮痛#65380;抗炎#65380;免疫#65380;抗癲癇及擴張血管等作用[2]#65377;新烏頭堿是附子中含量最高的生物堿，也是目前附子中研究較多的二萜生物堿，本試驗以附子中烏頭總堿含量為指標，考察附子提取液在多種樹脂中的吸附曲線及最佳洗脫條件，以優選出樹脂分離附子提取液中烏頭總堿的工藝條件，并得到純化的烏頭堿，為新藥研制奠定基礎#65377;

1材料與方法

1．1材料

附子50KG(采自四川綿陽江油地區)#65380;乙腈#65380;氯仿#65380;石油醚#65380;鹽酸#65380;NaOH#65380;乙酸乙酯等試劑均為分析純#65380;D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;D－001#65380;007×7(732)型樹脂(天源離子交換樹脂廠)#65380;烏頭堿#65380;新烏頭堿對照品(中國藥品生物制品檢定所)#65377;高效液相色譜(AKZO NOBEL)#65380;旋轉蒸發儀，恒溫水浴鍋(亞榮儀器廠)#65380;紫外分光光度計(上海光譜公司)#65380;電子天平#65377;

1．2方法

1．2．1粗提取50 kg的附子進行粉碎，并放置于真空干燥箱中，450C條件下12 h，取出待用#65377;用3倍量的95%乙醇溶液進行浸泡3次，減壓濃縮成浸膏，待用#65377;

1．2．2樹脂純化

1)樹脂預處理用體積分數為95%的乙醇溶液浸泡24 h使其樹脂能充分溶脹，濕法裝柱，用乙醇以2BV·h^－1的流速通過樹脂層，洗至流出液與水無乳白色混濁停止#65377;然后用水以同樣的流速洗凈乙醇#65377;再用5倍樹脂體積的5%HCl以4~6BV·h^－1的流速通過樹脂柱#65377;然后用水以同樣流速洗至流出液呈中性#65377;用5倍體積的5%的NaOH以4~6BV·h^－1的流速通過樹脂柱，然后用水以同樣流速洗至流出液呈中性，備用[3]#65377;

2)樹脂篩選對D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;007×7(732)#65380;D－001型樹脂進行篩選，確定D^－101#65380;X－5#65380;AB－8大孔吸附樹脂為分離烏頭總堿的最佳材料#65377;

3)樹脂靜態吸附檢測通過不同的溫度#65380;溶液濃度#65380;pH對其吸附洗脫條件進行優化#65377;

4)樹脂動態吸附檢測對D^－101#65380;X－5#65380;AB－8進行動態吸附的測定，并確定不同濃度的乙醇溶液的洗脫效果#65377;

1．2．3含量測定方法參照文獻[4]川烏附子含量測定的方法#65377;使用濃度0．O1mol·L^－1的硫酸滴定液，其每1 mL相當于12．9 mg的烏頭堿(C34H47NO11)#65377;按下式計算總烏頭堿的提取率#65377;提取率%=(m1/m2)×100%，式中，m1為提取液中總烏頭堿的質量，m2為提取用附子藥材中總烏頭堿的質量#65377;同時，參照文獻[4]，精密稱取附子提取液分別在0#65380;2#65380;4#65380;8#65380;10#65380;12 h測定溶液成分，測得12 h內穩定性良好#65377;

1．2．4色譜條件色譜柱為Kromasil C18柱[4．6 mm×250 mm(Scienhome)]，檢測波長：235 nm，流速：0．8 mL·min^－1，柱溫：300℃，流動相：體積分數為0．26%的三乙胺溶液(A相)及甲醇(B相)，按表1進行梯度洗脫[5，6]#65377;

2結果與分析

2．1生物總堿的粗提

2．1．1浸泡溶劑的選擇對于總生物堿的提取分別采用了pH值2～3酸水#65380;75%#65380;85%#65380;95%乙醇溶劑#65380;親脂性有機溶劑提取法，比較總生物堿含量#65377;分別加4倍量溶劑浸泡1 d后減壓濃縮，調pH值3．0～4．0靜置12 h，濃縮[7]#65377;測定總生物堿的含量依次為40．1%，75．5%，94．3%，98．1%，85．1%#65377;由此可確定95%乙醇的提取率最高#65377;

2．1．2溶劑用量的選擇取附子粉適量，分別用1#65380;2#65380;3#65380;4#65380;5#65380;6倍量體積分數為95%的乙醇溶液作溶劑，測定其含量變化，發現當溶劑量達到3倍以后，生物堿含量的提高就變慢了，出于成本考慮，本試驗里使用3倍溶劑量進行提取#65377;

2．1．3提取時間的選擇工業化提取時由于量較大，不方便使用加熱等手段而需要在常溫下浸泡提取#65377;設定提取時間分別為1#65380;2#65380;3#65380;4#65380;5#65380;6#65380;7#65380;8#65380;9#65380;10 d，測定其含量變化，當從第5天開始，生物堿含量的變化就不明顯，因此，選擇5 d為最佳浸泡時間，對于浸泡完的殘渣進行再次浸泡，測定含量變化，發現在第3天后含量變化不明顯，因此，選擇3 d為最佳浸泡時間，對于剩下的殘渣再次進行浸泡，并且測定含量，發現第1天后含量變化不明顯，比較第1次第6天增加量#65380;第2次第4天增加量#65380;第3次第1天增加量，第3次第2天增加量，發現其含量為第3次第1天最高，而第3次第2天增加量非常低，因此，3次浸泡有必要并且為最佳浸泡時間#65377;

2．2樹脂純化工藝優化

2．2．1樹脂的篩選根據文獻[8]，非極性和弱極性的樹脂與極性樹脂對二萜生物堿有不同的吸附效果，因此選擇常用的7種樹脂D^－101#65380;X－5#65380;AB－8#65380;NKA－9#65380;XAD－7#65380;D－001#65380;007×7(732)進行篩選#65377;取附子提取液適量，用氨水調pH值至5后備用#65377;將經過預處理過得7種樹脂D^－101，X－5，AB－8，NKA－9，XAD－7，D－001，007×7(732)加入過量溶液，室溫條件下在搖床上振搖24 h，使之充分吸附，測定吸附后溶液總生物堿的含量#65377;取靜態吸附飽和的樹脂，加體積分數為80%的乙醇溶液，在室溫條件下置搖床上振搖24 h，測定總的解吸附后生物堿的含量#65377;根據測定的結果，計算各樹脂的靜態吸附率與解吸附率，吸附率=(吸附前溶液濃度－吸附后溶液濃度)/吸附前溶液濃度×100%，結果見表2#65377;由表2可見，可以選擇的樹脂有D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 3種型號#65377;

2．2．2D^－101#65380;X－5#65380;AB－8 3種樹脂對附子總生物堿的靜態吸附溫度#65380;溶液的濃度#65380;pH是影響樹脂吸附效果的重要因素#65377;以靜態吸附為條件，正交試驗研究溫度#65380;溶液濃度#65380;pH因素影響，分別設置3個水平的正交試驗見表3#65377;

取一定量處理好的D^－101樹脂，加入一定質量濃度和pH值的溶液，在設定溫度條件下在搖床上振搖24 h，使之充分吸附，取靜態吸附飽和的樹脂，加體積分數為80%的乙醇溶液，在室溫條件下在搖床上振搖24 h，過濾后測定總生物堿的含量#65377;以解吸附的總生物堿量為指標制定正交試驗，結果及方差分析見表4#65377;由上面兩表結果可見，因素A顯著，即pH的影響最大，其次是溫度的影響，樣品濃度的影響不顯著，然而溶液濃度過高在上樣時容易對流速造成影響，質量濃度過低，溶液體積大，不利于吸附#65377;所以優化上樣條件是A1B1C2，即將6 _g·L^－1溶液調pH值為4．5#65380;溫度為18℃上樣#65377;

對X－5#65380;AB－8型號的樹脂靜態吸附結果顯示其最佳的吸附條件同D^－101，6 _g·L^－1溶液#65380;pH值4．5#65380;溫度18℃為最佳的上樣條件#65377;

2．2．3D^－101#65380;X－5#65380;AB－8樹脂對總生物堿的動態吸附將溶液(總生物堿質量濃度為0．6 _g·L^－1)，調pH值至4．5，緩慢加入裝有D^－101樹脂柱中，控制流速為1．0 mL·m^－1，每10 mL為1部分，滴定法測定總生物堿#65377;吸附曲線見圖1可見，從第8部份開始出現未吸附的生物堿，隨著流份數的增加至27份以后，D^－101樹脂對總生物堿的動態吸附趨于飽和吸附量可達301．5 mg#65377;由此可知上樣量為每1 mL樹脂載藥不超過15．03 mg#65377;同樣方法用于X－5#65380;AB－8#65380;X－5樹脂對總生物堿的動態吸附趨于飽和吸附量可達338．7 mg，每1 mL樹脂載藥不超過16．73 mg#65377;AB－8樹脂對總生物堿的動態吸附趨于飽和吸附量可達341．4 mg，每1 mL樹脂載藥不超過16．93 mg#65377;

2．2．4洗脫液的選擇以乙醇為洗脫液，以動態吸附圖為標準，使D^－101樹脂柱處于飽和吸附狀態，分別用蒸餾水#65380;10%#65380;20%#65380;40%#65380;60%#65380;80%#65380;95%的乙醇溶液作為洗脫液，每一部分洗脫5倍柱體積，洗脫液流速為1 mL·min^－1#65377;不同濃度洗脫物質如圖2#65377;由圖2可見，隨著乙醇濃度的提高，洗脫出來物質的量也越大，同樣對于X－5#65380;AB－8樹脂也隨著乙醇濃度的提高，洗脫出來物質的量逐漸增大，另再以洗脫總生物堿的固體含量為評價指標，測定結果見圖3#65377;由圖3可見，10%乙醇其洗脫物中總生物堿含量最高#65377;綜合分析，如果是為了得到純度最高的生物堿，可選用10%乙醇濃度，如果是為了得到最大量的生物堿，可選用95%乙醇#65377;對于X－5#65380;AB－8樹脂均在10%乙醇含量時其洗脫物中含有總生物堿含量最高，在95%乙醇濃度下洗脫物總生物堿總量最高#65377;

2．2．5D^－101樹脂再生周期考察將裝有D^－101樹脂的層析柱上反復進行吸附#65380;洗脫，測定樹脂對新烏頭堿重復吸附能力如圖4#65377;由圖4可見，當過了第5次吸附后，其吸附效果的降低開始加強，因此，未達到更好的效果，此類型樹脂最好使用不超過5次#65377;X－5#65380;AB－8樹脂最高使用次數不超過6次#65377;

3討論

確定附子總烏頭總堿的最佳提取條件為：加3倍藥材量的體積分數為95%的乙醇溶液作為溶劑，浸提3次，第1次5 d，第2次3 d，第3次1 d#65377;提取液調pH值3～4靜置12 h，回收乙醇并濃縮至一定體積，確定D^－101的最佳吸附洗脫條件為87．5%和95．3%，X－5最佳吸附洗脫條件為92．7%和88．7%，AB－8最佳吸附洗脫條件為93．6%和89．9%#65377;D^－101#65380;X－5#65380;AB－8大孔吸附樹脂純化時，上樣時藥液濃度為6 _g·L^－1，pH值為4．5，室溫為18℃以蒸餾水除雜，體積分數為95%的乙醇溶液1 mL·min^－1流速洗脫，濃縮洗脫液，完全蒸干，測定其中附子總生物堿的平均含量分別為D^－101高于48%#65380;X－5高于50%#65380;AB－8高于51%#65377;確定了10%乙醇溶液和95%乙醇溶液在洗脫烏頭總堿時的特點，對于正交分析中影響不明顯的濃度，確定了它在實際洗脫中的特點，并確定了其最佳的濃度#65377;

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