拮抗鏈霉菌Ｈ２１０發(fā)酵液抗菌譜及理化性質(zhì)

(1．沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽110161；2．山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，太原030031)

摘要：菌株H210發(fā)酵液抑菌活性生測結(jié)果表明，其對煙草野火病菌#65380;煙草角斑病菌和水稻白葉枯病菌等病原細(xì)菌的抑菌效果明顯，抑菌圈直徑分別為43 mm#65380;42．5 mm和37．4 mm；對瓜果腐霉病菌#65380;辣椒炭疽病菌#65380;煙草赤星病菌#65380;番茄灰霉病菌等病原真菌均有抑菌作用，抑菌圈直徑均在20 mm以上#65377;其發(fā)酵液的理化性質(zhì)測定表明，該菌株對紫外線#65380;光照#65380;酸和堿均有較好的穩(wěn)定性；繼代培養(yǎng)5代后抑菌活性基本無變化，遺傳特性穩(wěn)定；發(fā)酵液經(jīng)60℃溫度處理3 h，抑菌活性基本未受影響，但經(jīng)80℃處理時隨時間延長抑菌活性明顯下降#65377;

關(guān)鍵詞：鏈霉菌；發(fā)酵液；抗菌譜；穩(wěn)定性

中圖分類號：S476．1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：0439－8114(2008)06－0668－03

Study on Antagonistic Spectrum and Stability of Streptomyces Strain H210

ZHANG Xiao－wen1，GAO Fen2，WEI Ying－ying1，ZHAO Xiu－xiang1，WU Yuan－h(huán)ua1

(1 College of Plant Protection， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110161， China

2 Institute of Plant Protection， Shanxi Academy of Agricultural Sciences， Taiyuan 030031，China)

Abstract：H210 was isolated from soil samples， which had inhibition against 5 pathogenic bacteria such as Pseudomonas syringae pv．tabaci and Xanthomonas oryzae pv． oryzae． The diameters of inhibition zone were 43mm and 37．4mm respectively； The results also showed that the diameters of inhibition zone against 14 pathogens， such as Pythium aphanidermatum f．sp．melonis， Colletotrichum capsici， Alternaria alternata， Botrytis cinerea were more than 20mm． The physiological and chemical characteristics of the fermented broth were studied， and the results indicated that it was stable to subculture， UV， light， acid and alkali． Its activity was stable at 60℃ ，but sensitive at 80℃

Key words： Streptomyces spp．；fermentated broth；antagonistic spectrum；stability

作物細(xì)菌性病害是當(dāng)前病害防治的難點，常造成嚴(yán)重?fù)p失，如水稻白葉枯病#65380;煙草野火病#65380;煙草角斑病#65380;煙草青枯病#65380;大白菜軟腐病等都是近幾年在我國發(fā)病比較嚴(yán)重的細(xì)菌性病害#65377;目前防治細(xì)菌病害的藥劑種類缺少，化學(xué)藥劑主要有氯溴異氰尿酸#65380;噻菌銅#65380;氧氯化銅#65380;氧化亞銅#65380;二元酸銅#65380;絡(luò)氨銅等，但防效不理想；生物農(nóng)藥中僅有農(nóng)用鏈霉素#65380;中生菌素#65380;新植霉素等少數(shù)幾種制劑在生產(chǎn)上應(yīng)用[1－2]#65377;因此，加強(qiáng)針對細(xì)菌性病害的農(nóng)用抗生素的研發(fā)具有很好的應(yīng)用前景#65377;

本實驗室以病原細(xì)菌煙草野火病菌#65380;水稻白葉枯病菌為靶標(biāo)篩選出的拮抗鏈霉菌H210，在室內(nèi)活性測定中表現(xiàn)出了良好的抑菌活性，本文對其發(fā)酵液的抗菌譜及理化性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，報道如下#65377;

1材料與方法

1．1供試菌株

拮抗菌：菌株H210，由本實驗室從土壤中分離#65380;篩選，初步鑒定為鏈霉菌屬(Streptomyces spp． H210)#65377;其他病原菌均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病毒與基因工程研究室提供#65377;

靶標(biāo)菌：煙草野火病菌(Pseudomonas syringae pv．tabaci)水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv． oryzae)#65377;

1．2發(fā)酵液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉47 _g，花生粉22 _g，酵母粉2 _g，(NH4)2SO4 2．7 _g，CaCO3 2．7 _g，NaCl 2．7 _g，水1 000 mL，pH值7．2#65377;發(fā)酵時用250 mL三角瓶裝樣量50 mL#65377;

拮抗菌培養(yǎng)：菌株H210接種于高氏一號培養(yǎng)基斜面上，28℃恒溫培養(yǎng)4 d，待用#65377;

發(fā)酵方法：按接種量8%～10%(V/V)接種，孢子濃度為(105～106cfu·mL^－1)，恒溫震蕩培養(yǎng)(28℃#65380;180～190 r·min^－1)4 d，發(fā)酵液6 000 r·mim^－1離心15 min，取上清液過細(xì)菌過濾器去除菌體，得到發(fā)酵液無菌濾液，用于下面各項試驗#65377;

1．3抑菌活性及抗菌譜的測定

1．3．1拮抗鏈霉菌的活體抑菌活性活體抑菌活性測定采用瓊脂塊法[3－4]#65377;將鏈霉菌孢子制成混懸液并涂布平板，28℃恒溫培養(yǎng)5～7 d后，制備菌餅(直徑7 mm)#65377;將煙草野火病菌菌懸液(2×107～3×107cfu·mL^－1)0．7 mL，水稻白葉枯病菌菌懸液(3×107～4×107cfu·mL^－1)0．7 mL加到70 mL 50℃左右的NA培養(yǎng)基中，制成混菌平板，放置拮抗菌菌餅，28℃恒溫培養(yǎng)24 h后十字交叉法測量抑菌圈直徑#65377;試驗設(shè)3次重復(fù)#65377;

1．3．2拮抗鏈霉菌發(fā)酵液的抑菌活性發(fā)酵液抑菌活性測定采用管碟法[5－6]#65377;同1．3．1制備混菌平板，等距離放置無菌牛津杯，加入發(fā)酵液200 μL，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，十字交叉法測量抑菌圈直徑#65377;試驗設(shè)3次重復(fù)#65377;

1．3．3發(fā)酵液的抗菌譜測定將各類病原菌分別制成混菌平板，冷卻后放入牛津杯，加發(fā)酵液200 μL，28℃恒溫培養(yǎng)，真菌48 h#65380;細(xì)菌24 h后測量抑菌圈直徑#65377;

1．4發(fā)酵液理化性質(zhì)的測定

1．4．1熱穩(wěn)定性測定試驗設(shè)3個處理：將菌株發(fā)酵原液于60#65380;80#65380;100℃水浴下分別處理0．5#65380;1#65380;2#65380;3 h后，各取出1 mL自然冷卻，以原始發(fā)酵液為對照，管碟法測定生物活性#65377;

1．4．2對紫外光和光照穩(wěn)定性的測定在無菌培養(yǎng)皿中加入等量發(fā)酵液，置于紫外線(λ2537?魡，距離15 cm)下分別照射1#65380;2#65380;4 h；置于裝有8只30W日光燈的光照培養(yǎng)箱中，分別照射3#65380;6#65380;12 h后取樣測定生物活性#65377;

1．4．3酸#65380;堿穩(wěn)定性的測定取10份樣品，每份10 mL發(fā)酵液，用1 mol·L^－1 HCl和1 mol·L^－1 NaOH分別調(diào)pH值2～11，然后將每份調(diào)好的樣品分裝試管，測定其抑菌活性#65377;

1．4．4遺傳穩(wěn)定性測定將菌株原始純化菌作為F1代，繼代培養(yǎng)至F5代，每代培養(yǎng)5～6 d，將1～5代的菌株常規(guī)發(fā)酵，測定發(fā)酵液抑菌活性#65377;

2結(jié)果與分析

2．1發(fā)酵液抑菌活性及抗菌譜的測定結(jié)果

2．1．1拮抗鏈霉菌活體和發(fā)酵液的抑菌活性菌株H210活體的抑菌試驗表明：該菌株的活體對病原細(xì)菌有明顯的抑菌活性，對靶標(biāo)菌煙草野火病菌#65380;水稻白葉枯病菌活體抑菌圈直徑分別為25．0 mm和24．2 mm；發(fā)酵液的無菌濾液也有明顯的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為41．7 mm和38．6 mm，重復(fù)發(fā)酵后抑菌效果穩(wěn)定#65377;

2．1．2發(fā)酵液的抗菌譜測定菌株H210發(fā)酵液的抗菌譜較廣#65377;在病原細(xì)菌中，對煙草角斑病菌#65380;煙草野火病菌抑菌圈直徑分別為42．5 mm和43．0 mm；對煙草青枯病菌#65380;水稻白葉枯病菌抑菌圈直徑都在30 mm以上#65377;在病原真菌中，對瓜果腐霉病菌的抑菌圈直徑最大，為42．0 mm，其次是辣椒炭疽病菌，為38．0 mm#65377;另外，對煙草赤星病菌#65380;番茄灰霉病菌#65380;小麥赤霉病菌#65380;辣椒根腐病菌#65380;香瓜枯萎病菌#65380;水稻惡苗病菌的抑菌效果也較好，抑菌圈直徑均在30 mm以上(表1)#65377;

2．2發(fā)酵液理化性質(zhì)的測定結(jié)果

2．2．1熱穩(wěn)定性測定熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，菌株H210熱穩(wěn)定性一般#65377;在60℃下處理，隨加熱時間延長，抑菌圈開始減小，但不明顯；在80℃下處理時，抑菌活性遞減明顯，處理到3 h時，抑菌圈直徑降為25．3 mm，與對照相比，抑菌活性降低了39．8%；100℃處理時，抑菌活性顯著降低，3 h后抑菌活性基本喪失(圖1)#65377;

2．2．2紫外光及自然光照射下的穩(wěn)定性測定菌株H210的發(fā)酵液經(jīng)紫外光和自然光照射后，抑菌活性均下降不明顯，表現(xiàn)出了對紫外光和自然光良好的穩(wěn)定性(圖2#65380;圖3)#65377;

2．2．3酸堿的穩(wěn)定性測定菌株H210的發(fā)酵液在中性#65380;酸性條件下較穩(wěn)定，當(dāng)pH=6～7時，抑菌活性最高，堿性條件下抑菌圈直徑略有下降，但下降不明顯(表2)#65377;

2．2．4遺傳穩(wěn)定性測定菌株H210經(jīng)連續(xù)5次傳代培養(yǎng)后，其發(fā)酵液的抑菌活性變化不明顯，抑菌圈直徑分別為42．6#65380;42．0#65380;41．8#65380;41．5和41．3 mm，第5代的抑菌圈直徑比出發(fā)菌株的直徑只減少1．3 mm，僅下降3．1%，說明其遺傳特性穩(wěn)定#65377;

3小結(jié)與討論

1)生物農(nóng)藥的開發(fā)是目前植物保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點之一，但用于防治細(xì)菌性病害的生防制劑的開發(fā)少見報道#65377;本實驗室篩選得到的菌株H210的發(fā)酵液在室內(nèi)平皿試驗中表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，且抗菌譜廣，尤其是對病原細(xì)菌表現(xiàn)出了顯著的抑制作用#65377;發(fā)酵液理化性質(zhì)的測定結(jié)果表明，該菌株對紫外線#65380;酸堿等不良環(huán)境條件耐受性較好，遺傳特性也較為穩(wěn)定#65377;盡管其對高溫敏感，但可以通過誘變等途徑進(jìn)行改良，從而進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用研究#65377;

2)本文抗菌譜測定中所選用的供試病原真菌和病原細(xì)菌種類有限，尚需擴(kuò)大研究#65377;另外，其田間藥效還需要進(jìn)一步驗證#65377;

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