人乳鐵蛋白腺病毒載體的構建及細胞表達

(燕山大學環化學院生物技術與工程系，河北 秦皇島066004)

摘要：將人乳鐵蛋白基因與腺病毒基因組骨架質粒重組，在293細胞中包裝重組腺病毒顆粒，獲得真核細胞表達的載體pAd－hLTF#65377;以pcDNA3X為模板，PCR擴增hLTF基因，腺病毒穿梭載體pshuttle－cmv與hLTF重組為pshuttle－cmv－hLTF；再與腺病毒骨架質粒pAdEasy^－1同源重組為pAd－hLTF質粒；脂質體法將重組pAd－hLTF質粒轉染HEK 293細胞，包裝成重組腺病毒顆粒#65377;Western blot和ELISA法測定細胞中hLTF基因的表達#65377;結果表明，pAd－hLTF質粒轉染293細胞后，7～10 d后，獲得細胞裂解液，將細胞裂解產物再次接種新鮮的293細胞，3～5 d后，80%以上的細胞變圓#65380;膨脹#65380;漂浮#65377;Western blot和ELISA結果顯示，上清液中有hLTF基因的表達，為重組人乳鐵蛋白的體外表達及其功能分析奠定了基礎#65377;

關鍵詞：重組人乳鐵蛋白；腺病毒載體；重組蛋白質

中圖分類號：Q513+．2；S852．65+9．1；Q782文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0629－04

Construction of Human Lactoferrin Gene Recombinant Adenoviruses and Expression in Eukaryotic Cells

HAN Zeng－sheng，LI Jian，GAO Da－wei，LI Qing－wang

(Department of Biological Engineering，College of Environment Chemical Engineering，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)

Abstract： To construct the recombinant adenoviral vectors containing human lactoferrin gene， the recombinant adenoviruseswas obtained and expressed the recombinant protein in eukaryotic cells． The human lactoferrin gene was amplified from plasmid pcDNA3X； the gene of interest which contained hLTF gene was cloned into the pshuttle－cmv vector． The resulted vector was named pshuttle－cmv－hltf that was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI， and subsequently cotransformed into Escherichia coli BJ5183 cells with an adenoviral backbone vector pAdEasy^－1； Homologous recombinants were performed in bacterial cells． Finally， the linearized backbone adenoviral vector was transfected into the packaging cells lines HEK 293 cells by lipofectamine 2000 transfection reagents． The expression of human lactoferrin in cells was investigated by Western blot and ELISA methods． After the transfection， seven to ten days later， the cells lyses were collected and added into the separate 293 cells． The cells become roundness， swell and floats． Western blot and ELISA results showed the high expressed human lactoferrin in the cells． These results shown that human lactoferrin gene recombinant adenoviral backbone vector had been constructed successfully． The recombinant adenoviruses pAd－hLTF had been produced by packaging in 293 cells． This study could provide the possibility of further researches on the high－level expression of recombinant proteins．

Key words： recombinant human lactoferrin； adenoviral vectors； recombinant protein

人乳鐵蛋白(human lactoferrin，hLTF)是主要存在于初乳中的一種結合性糖蛋白，由于乳鐵蛋白具有許多獨特的生物學功能，如廣譜的抗菌性及免疫作用#65380;抗氧化作用#65380;抗炎癥#65380;抗病毒#65380;抗癌癥作用等[1]生物學功能，近年來成為國內外研究的熱點#65377;目前人乳鐵蛋白已在多種基因表達系統中獲得成功表達，如乳腺[2]#65380;煙草[3]#65380;昆蟲[4]#65380;酵母[5]等系統中均表達了hLTF重組蛋白#65377;但上述表達系統均存在一些缺陷，如轉基因乳腺表達需要特異啟動子，以及制作轉基因動物效率低#65380;成本高，且煙草和酵母基因表達系統所得重組真核蛋白存在生物活性不高和不易純化的缺點#65377;為此，有必要探索新的重組人乳鐵蛋白的高效表達方法#65377;腺病毒載體表達系統是近年來應用于人類基因治療中最為廣泛的真核載體表達系統之一#65377;由于腺病毒載體本身具有安全性好和轉基因效率高的優點，被廣泛應用于真核基因的表達和癌癥的基因治療中[6]，本研究構建了含有人乳鐵蛋白的腺病毒載體，并進行了重組人乳鐵蛋白腺病毒在細胞中的表達試驗，以期獲得可以高效表達的重組人乳鐵蛋白腺病毒顆粒，為重組人乳鐵蛋白的體外高效表達奠定了基礎，也可為其他重組蛋白質的高效表達提供一定的參考#65377;

1材料與方法

1．1細胞#65380;菌株及培養

HEK 293(人胚胎腎細胞系)來自于中國醫學科學院細胞中心，Escherichia coli BJ5183菌株由張智英先生惠贈#65377;293細胞培養于DMEM基礎培養基中添加100 U·mL^－1雙抗(青霉素100，000 U·mL^－1+鏈霉素100，000 U·mL^－1)#65380;1%非必需氨基酸(NAA)(Gibco)#65380;10%胎牛血清(FBS，Hyclone)#65377;37℃，5% CO2培養箱#65377;

1．2主要試劑

限制性內切酶#65380;DNA連接酶#65380;Taq DNA聚合酶等工具酶類均來自大連寶生物工程有限公司；人乳鐵蛋白ELISA試劑盒購自美國USBiological公司；脂質體lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；人乳鐵蛋白單克隆抗體購自Sigma公司#65377;

1．3重組穿梭載體的構建

含有人乳鐵蛋白基因的pcDNA3X質粒由我們實驗室克隆保存，分別以Kpn I/Xho I消化后，接入以同樣酶Kpn I/Xho I消化的pshuttle－cmv載體，獲得陽性重組子后，命名為pshuttle－cmv－hltf，并送往上海英俊公司進行測序#65377;經測序以及限制性內切酶消化重組質粒pshuttle－cmv－hltf鑒定正確后，將其轉化DH5α感受態細胞，進行大量擴增，堿裂解法抽提質粒并純化備用#65377;

1．4腺病毒載體的構建

將pshuttle－cmv－hlTF質粒以Pme I酶消化使其線性化，利用PCR產物純化試劑盒純化線性化質粒pshuttle－cmv－hlTF，腺病毒骨架質粒pAdEasy^－1和線性化質粒pshuttle－cmv－hlTF共轉化大腸桿菌BJ5183感受態細胞進行同源重組，限制性內切酶鑒定重組腺病毒載體pAd－LTF#65377;

1．5重組腺病毒的包裝

將酶切鑒定正確的重組腺病毒載體pAd－LTF進行Pac I酶切消化，膠回收試劑盒回收約33kb大小的片段，將該大片段以脂質體法轉染293細胞，轉染4 h后，細胞換成完全培養基培養，即DMEM基礎培養基中添加10% FBS，37℃，5%CO2培養箱#65377;每日觀察細胞，記錄細胞生長狀態#65377;轉染7～10 d后，細胞會出現變圓和脫落等現象，小心收集細胞及上清，將細胞反復凍融3次(分別置于液氮和37℃水浴)，離心后獲得上清液，即為病毒的初級產物，于－70℃貯存，或直接用于下一步病毒擴增試驗#65377;

1．6重組病毒的擴增與鑒定

將病毒初級產物接種于細胞生長匯合率為50%～70%的293細胞，感染3～5d后，根據細胞脫落狀況判斷收獲病毒時間，若細胞90%以上出現飄落時，立即收集細胞及上清，同樣，將細胞反復凍融3次，最終獲得病毒的擴增產物#65377;而后，取細胞上清液10 μL，加入蛋白酶K，于50℃孵育1 h，離心后取上清為模版，分別進行PCR鑒定#65377;以hLTF特異引物進行PCR擴增，可獲得約2．2kb的目標片段，引物分別為：F11—GGTCTATATAAGCAGAGCTG；R12—CTGATCATAATCAGCCATACCAC#65377;以腺病毒基因組和hLTF的結合處設計引物，可獲得約1．2kb的目標片段，引物分別為：F21—ATTTCAGTCAAAGCTGTG

CCCCTG；R22—CTCAGGAAAGCAAAGTCAGTCAC#65377;

1．7重組腺病毒的細胞表達

將鑒定正確的pAd－LTF重組腺病毒接種293細胞，感染48 h后，取上清分別進行Western blot和ELISA分析，以檢測人乳鐵蛋白在細胞中的表達效果#65377;

2結果與分析

2．1重組穿梭載體的鑒定

將重組的陽性質粒pShuttle－hLTF進行3種不同限制性內切酶分析，所獲瓊脂糖電泳大小片段與預期的完全一致(圖1)#65377;經送往測序公司的結果分析，所測序列與國際GENEBANK上AY875691和AY178998登錄的人乳鐵蛋白序列基本一致#65377;上述結果表明，已正確獲得了人乳鐵蛋白基因克隆，并已完成了腺病毒穿梭載體的構建#65377;并可用于下一步重組腺病毒載體的構建#65377;

2．2重組腺病毒載體pAd－hLTF的鑒定

利用AdEasy腺病毒骨架系統，在BJ5183細菌內同源重組而獲得的腺病毒載體，用PacI酶切后將會出現3．0kb大小的特異條帶，分別以pAdEasy^－1質粒為空白對照，同時用PacI消化pAd－hLTF和pAdEasy^－1質粒，僅在pAd－hLTF消化產物中出現了約3．0kb大小的特征性小條帶(圖2)#65377;證明已成功構建獲得重組人乳鐵蛋白腺病毒載體pAd－hLTF#65377;由于重組質粒大于30kb，所以用1%的瓊脂糖電泳時大片段容易跑不出，出現部分質粒停留在泳道口的現象，但這不影響結果分析#65377;

2．3重組腺病毒載體轉染293細胞結果

利用陽離子脂質體法，將PacI消化的pAd－hLTF載體轉染293細胞，轉染4h后，若在顯微鏡下看到細胞形狀稍有變化，則立即取出脂質體，更換培養基為完全培養基#65377;繼續培養7～10 d后，可看到細胞有明顯的變化，主要表現為細胞腫脹#65380;容易脫落和漂浮于培養液中#65377;待到80%細胞出現上述現象后，收集細胞和上清液，同時進行PCR鑒定初級病毒產物#65377;分別使用了2對引物進行PCR鑒定，瓊脂糖電泳分別獲得2．2kb和1．2kb兩條片段，結果與預期完全一致(圖3)#65377;

2．4pAd－hLTF在細胞中的表達

將鑒定正確的pAd－hLTF用于進一步的細胞表達試驗，分別于不同接種密度的細胞培養皿中加入pAd－hLTF病毒，于48 h后，開始檢測細胞上清中hLTF的表達，以兔抗人乳鐵蛋白單克隆抗體為一抗，辣根過氧化酶標記的羊抗兔免疫球蛋白為二抗，Western blot雜交試驗結果顯示，在約80kD處有一條特異的蛋白條帶，與人乳鐵蛋白標準品條帶一致，表明pAd－hLTF載體在細胞里獲得了正確表達(圖4)#65377;同時，利用人乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒(USBiological，USA)，對細胞上清進行了檢測，酶標儀450 nm處讀數，陰性對照孔值平均0．064 1，陽性標準品對照孔值平均0．235，上清液樣品孔值平均為0．243，表明上清液中有較高水平的重組人乳鐵蛋白的表達#65377;

3討論

在基因工程技術中，重組蛋白質的表達一直以來是人們所研究的熱點之一，特別是隨著人類基因組計劃的完成，大量的人源性基因急需表達，以便研究其結構和功能#65377;本研究以人乳鐵蛋白為目標基因，成功構建了重組腺病毒載體pAd－hLTF，并在細胞里獲得了重組人乳鐵蛋白的較高水平的表達#65377;另外，以腺病毒為載體，我們實驗室同時做了人生長激素基因#65380;人紅細胞生成素基因和神經生長因子等基因的細胞表達，均獲得了重組基因的表達#65377;由此可揭示出，重組腺病毒表達系統可用于其他真核基因的體外快速表達和鑒定#65377;

構建腺病毒載體的主要思路是刪除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能夠通過同源重組的方式進入病毒基因的框架[6]#65377;外源基因主要進入E1區，因為E1區是病毒復制所必需的，缺失E1區的腺病毒可以在反式提供E1區編碼產物的細胞系中，如HEK 293細胞系中復制#65377;而E3區的缺失主要是為了擴大病毒的包裝容量#65377;

本研究中采用pAdEasy腺病毒載體系統，通過細菌同源重組產生腺病毒載體的方法[7]，該方法是利用重組酶缺陷型大腸桿菌(如BJ5183，recBCsbcBC)高效的同源重組機制得以實現的#65377;該法中的腺病毒骨架質粒包含全長病毒序列(或E3區缺陷)，且末端帶有PacI酶切位點(8bp內切酶識別序列)#65380;氨芐青霉素抗性基因和質粒復制區#65377;穿梭質粒包含病毒基因組左側區序列ITR序列#65380;病毒包裝信號序列及與E1區下游的一段同源序列#65377;首先，將構建含有目標基因的穿梭質粒，然后與病毒載體兩個質粒載體共轉化于recBCsbcBC型大腸桿菌(BJ5183)，挑取單菌落獲得陽性重組質粒，經過限制性酶切分析，正確的重組子再轉染HEK 293細胞，從而獲得重組腺病毒#65377;該方法可以最大程度避免野生型腺病毒的產生，所以重組成功率較高[6，7]#65377;另外，細菌內重組的方法無需進行繁瑣的病毒空斑化篩選，因而省時省力#65377;因此，通過本試驗pAd－hLTF的成功構建，可為人乳鐵蛋白腺病毒載體的構建以及其他重組腺病毒載體的構建提供一定的依據#65377;

參考文獻：

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