東北刺人參遺傳多樣性的ＲＡＰＤ分析

(延邊大學農學院，吉林 龍井133400)

摘要：應用RAPD技術對7份來源于不同區域的東北刺人參進行了分析，從100條隨機引物中篩選出16條引物，共擴增出117條譜帶，其中51條為多態帶，多態性比率為43．62%，其多態性比率較低#65377;系統聚類分析將7份東北刺人參居群分為2大類群，長白山老嶺山脈的東北刺人參居群聚為一類，長白山主峰南側的東北刺人參居群聚為一類#65377;東北刺人參總體較低的遺傳多樣性是導致其瀕危的原因之一#65377;

關鍵詞：東北刺人參；聚類分析；RAPD

中圖分類號：S567．5+3；Q503文獻標識碼：A文章編號：0439－8114(2008)06－0627－02

RAPD Analysis of Genetic Diversity for Endangered Oplpanax elatus

GAO Ri，LIAN Mei－lan，WU Song－quan，PIAO Xuan－chun

(Agricultural College of Yanbian University， Longjing 133400，Jilin，China)

Abstract：In this study， 7 Oplpanax elatus samplies from different regions of Changbai Mountain were analyzed by using RAPD techniques． 16 polymorphic primers， screened out from 100 random primers， were used and produced 117 reproducible bands． Of them， 51 bands (43．62%) were polymorphic． By cluster analysis the germplasm used in this study was divided into 2 groups： O． elatus of Laoling Mountain for one group， O． elatus of south of Changbai Mountain for the other． The lower genetic diversity was one of the reasons of O． elatu．endangerment．

Key words：Oplpanax elatus； cluster analysis； RAPD

東北刺人參(Oplpanax elatus Nakai)系五加科刺人參屬多年生落葉灌木，又名北五加#65380;刺人參，其分布區域十分狹窄，全世界只在中國#65380;俄羅斯#65380;朝鮮等3國境內有少量分布[1]，在我國主產于吉林省長白山海拔700～1 900 m的針葉林帶及遼寧東部山區海拔800～1 000 m的松杉林下#65377;據近幾年的調查，整個長白山區小片生長的天然東北刺人參已屈指可數，散生的也已不多[2]，必須采取有效措施予以保護#65377;幾年來，國內對東北刺人參的致瀕因素和保護對策也進行了一些探討[3，4]，但尚未見有關東北刺人參遺傳多樣性的研究報道#65377;遺傳多樣性的研究不僅有助于了解物種的進化歷史和適應潛力，以及探討物種瀕危的機制，同時也關系到能否采取科學有效的措施來保護物種#65377;用于遺傳多樣性分析的方法很多，其中RAPD方法由于具有簡便#65380;靈敏#65380;費用相對便宜#65380;而且可以檢測到大量多態位點等優點，已被廣泛地用于研究，并獲得了滿意的結果#65377;本文利用RAPD分子標記法對東北刺人參群體的遺傳多樣性進行了分析，旨在揭示東北刺人參植物的瀕危機制，為更好地保護東北刺人參種群奠定基礎#65377;

1材料與方法

1．1材料

野外采集供試東北刺人參植株當年生嫩葉，每地區隨機選取10株東北刺人參的葉片，裝入保鮮袋，封口，置于樣品貯藏箱(由超低溫冰袋維持冷藏條件)中帶回實驗室，－70℃保存待用#65377;各采樣地概況和采樣數詳見表1#65377;

1．2RAPD分析

1．2．1基因組DNA的提取DNA的提取采用CTAB[5]法，提取DNA后，應用Michemor等的分離群體分組分析法，分別將每個地區的10株DNA樣品等量混合，組成7個不同地區的基因池#65377;

1．2．2DNA擴增反應程序反應程序設置為：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，37℃退火60 s，72℃延伸90 s，40個循環，最后72℃延伸7 min#65377;反應體系為(20 μL)：9．8 μL ddH2O，250 μmol·L^－1 dNTP，2．0 μmol·L^－1 MgCl2，2．0 μL10×Buffer，0．3 μmol·L^－1引物，10 ng DNA模板，1．5 U Taq DNA聚合酶#65377;

1．2．3電泳檢測PCR擴增反應結束后，采用0．5×TBE 電泳緩沖液，1．4%的瓊脂糖凝膠(含0．5 μg·mL^－1 EB)電泳#65377;取10 μL擴增產物與2 μL電泳載體緩沖液混勻，電壓為80 V，電泳產物在GDS－8000型凝膠成像儀下觀察，拍照#65377;

1．3數據分析

根據片段的有無，用1表示有帶，用0表示無帶， 用MEGA3．1軟件p－distance來構建遺傳距離矩陣，用UPGMA法(非加權的成對算術平均法)構建RAPD聚類樹狀圖#65377;

2結果與分析

2．1引物的篩選

100個隨機引物進行PCR擴增，篩選出譜帶清晰#65380;穩定#65380;重復性好#65380;多態性明顯的16個引物(表2)用于正式的擴增反應#65377;

2．2RAPD擴增帶的多態性分析

利用16個隨機引物對7個東北刺人參居群進行RAPD分析，共擴增出117條譜帶，其中51條表現出多態性，占43．62%，平均每個引物擴增出7．31條譜帶，其中3．19條為多態性譜帶(表3)，說明東北刺人參居群表現出較低的遺傳多樣性#65377;圖1為引物OPD15對7個不同地區擴增的結果#65377;

2．3東北刺人參居群間聚類分析

根據16條引物擴增產物的統計結果，計算出遺傳距離，其范圍為0．120～0．316，平均遺傳距離為0．224，用MEGA程序中的非加權組法(UPGMA)進行聚類分析，得到居群間親緣關系分支樹系圖(圖2)，以遺傳距離0．222為標準，聚類為2大類群，位于長白山老嶺山脈的東北刺人參居群聚為一類，包括通化白雞腰子(THBJ)#65380;通化石湖(THSH)#65380;撫松漫江(FSMJ)#65380;臨江東小山(LJDX)#65380;白山大鏡(BSDJ)#65377;位于長白山主峰南側的東北刺人參居群聚為一類，包括長白十五道溝(CB15)#65380;長白十九道溝(CB19)#65377;

3討論

東北刺人參適宜生長在郁閉度較高的環境里[3]，而長白山主峰南側由于人為破壞生境(森林采伐)，造成采樣地空曠，周圍無較大的樹木，郁閉度小，植株較矮??；而長白山老嶺山脈采樣地郁閉度較大，植株較高，這很可能是本研究中7份來源不同的長白山區東北刺人參分為長白山主峰南側和老嶺山脈兩類的緣故#65377;從DNA分子水平上說，遺傳距離的變幅越大，說明其遺傳分化越大；遺傳多樣性越高，表明遺傳背景的復雜及該物種存在歷史的久遠[6]#65377;從研究的結果來看，來源不同的7份種質的遺傳距離分布在0．120～0．316之間，平均遺傳距離為0．224，可見東北刺人參遺傳多樣性比較狹窄，加之近幾年由于人為采食，導致其數量急劇下降#65377;因此，為了保護這一珍貴的藥用植物資源，我們必須加強對東北刺人參生態環境的保護，同時還應采用組織培養技術等來擴繁東北刺人參，以實現東北刺人參種質資源的可持續性利用#65377;

參考文獻：

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[2]王章淮． 東北刺人參的引種繁殖[J]．自然資源研究，1980(3)：61－63．

[3]周繇．長白山區東北刺人參的資源調查及其開發利用[J]．特產研究，2002(3)：44－46．

[4]劉繼生，張鵬，張美淑． 東北刺人參種子繁殖技術研究[J]．特產研究，2001，27(1)：27－29．

[5]鄒喻蘋，葛頌，王曉東．系統與進化植物學中的分子標記[M]． 北京：科學出版社，2001．16－47．

李俊麗，向長萍，張宏榮，等． 南瓜種質資源遺傳多樣性的RAPD分析[J]． 園藝學報，2005，32(5)：839．