“復(fù)方補(bǔ)益湯”對(duì)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)大鼠血漿Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ的影響

摘要：探索中藥“補(bǔ)益湯”對(duì)血漿中支鏈氨基酸Val、Leu、Ile的積極影響。運(yùn)用運(yùn)動(dòng)生物化學(xué)方法對(duì)大鼠建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎糜斡居?xùn)練并將大鼠分為安靜對(duì)照組、訓(xùn)練對(duì)照組、安靜中藥組、訓(xùn)練中藥組。實(shí)驗(yàn)10周后取材，液相色譜法檢測(cè)大鼠血漿中纈氨酸(Va1)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)的濃度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以補(bǔ)血、補(bǔ)陰類為主的復(fù)方補(bǔ)益藥符合辯證施治的原則，對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠有積極恢復(fù)作用。服用“復(fù)方補(bǔ)益湯”大鼠在安靜狀態(tài)與訓(xùn)練狀態(tài)下亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)增加明顯，提高了大鼠機(jī)體運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能力與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后恢復(fù)能力。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動(dòng)生化；復(fù)方補(bǔ)益湯；支鏈氨基酸；運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞；大鼠

Effects of “Complex Invigoration Tonic” on Val， Leu and Ile in blood plasma of rats exercising over a long period of time

LIU Chen

（School of Physical Education and Health，Guangzhou TCM University，Guangzhou 510006，China）

Abstract: In order to probe into the effects of “Invigoration Tonic”， a traditional Chinese medicine， on Val， Leu and Ile of branched chain amino acid in blood plasma， the author applied a kinetic biochemical method to establish an experimental model for the rats， trained the rats for swimming， divided the rats into a calm control group， a trained control group， a calm and tonic taken group， and a trained and tonic taken group， tested the change of concentration of valine (Val)， leucine (Leu) and isoleucine (Ile) in blood plasma of the rats by means of liquid chromatography after 10 weeks of experiment， and revealed the following findings: the complex invigoration tonic used mainly for blood and Yin invigoration is in conformity with the principle of dialectical treatment， playing a positive role in the recovery of the rats from kinetic fatigue; Leu and Ile of rats taking “Complex Invigoration Tonic” increased significantly under calm and trained conditions; “Complex Invigoration Tonic” has enhanced the capacity of the rats’ body for sports training and recovery after sports training.

Key words: kinetic biochemistry；complex invigoration tonic；branched chain amino acid；kinetic central nervous fatigue；rat

運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞與血漿纈氨酸(Va1)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)關(guān)系密切。它們?cè)隗w內(nèi)氧化分解產(chǎn)生ATP的效率高于其它氨基酸，在特殊生理時(shí)期(如運(yùn)動(dòng)、饑餓)時(shí)，是體內(nèi)重要的能量來源。長(zhǎng)時(shí)間較大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)血液中的氨基酸物質(zhì)直接提供能量作用于骨骼肌，維持肌肉的收縮。近年來有研究證明，補(bǔ)充支鏈氨基酸BCAA等物質(zhì)緩解中樞疲勞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證明[1]。

目前大多中藥抗運(yùn)動(dòng)疲勞的研究多從“補(bǔ)氣助陽”入手，應(yīng)用“養(yǎng)陰”方法抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究報(bào)道還很少。而從中醫(yī)整體觀出發(fā)，陰虛內(nèi)熱也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的重要機(jī)制。“復(fù)方補(bǔ)益”中藥是現(xiàn)今運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)的常見中藥，其主要功效在于補(bǔ)虛益損、扶正固氣，有所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”之說。有文獻(xiàn)報(bào)道我國(guó)跳水奧運(yùn)冠軍胡佳、吳敏霞等在2004年奧運(yùn)會(huì)備戰(zhàn)期間就服用過“復(fù)方補(bǔ)益湯”，主要調(diào)節(jié)因運(yùn)動(dòng)性疲勞引起的“脾腎虛弱、肝血不足”和“心血不足、心腎不交”等癥候群，收到了極其滿意的效果[2]。

本實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)“復(fù)方補(bǔ)益”中藥在抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用研究的基礎(chǔ)上，探討它對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠血漿Val、Leu、Ile的作用，為進(jìn)一步探索“復(fù)方補(bǔ)益”類藥物緩解運(yùn)動(dòng)疲勞機(jī)理提供先期理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1大鼠運(yùn)動(dòng)性中樞疲勞模型的建立

將訓(xùn)練組大鼠以漸增方式進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間游泳訓(xùn)練，水溫28~30℃。大鼠在專門實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物游泳池中進(jìn)行被迫無負(fù)重方式游泳，游泳池為長(zhǎng)方形，體積為90 cm×120 cm×100 cm，水深80 cm。在建模時(shí)間上嚴(yán)格遵循運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練科學(xué)中機(jī)體適應(yīng)鞏固性原則(表1)，在第5、7、9周都采取鞏固適應(yīng)性訓(xùn)練，使建模過程更加模擬實(shí)踐訓(xùn)練，力求實(shí)驗(yàn)研究更加科學(xué)準(zhǔn)確。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

采用健康雄性Wistar大鼠，5只/籠飼養(yǎng)，體重190~210 g。置于室溫20~22 ℃清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲水。在實(shí)驗(yàn)前2周開始適應(yīng)性游泳訓(xùn)練及喂養(yǎng)，剔除不善于游泳者，并根據(jù)體重按層次進(jìn)行隨機(jī)分組。劃分為安靜對(duì)照組、訓(xùn)練對(duì)照組、安靜中藥組、訓(xùn)練中藥組4個(gè)組別。

安靜對(duì)照組(組1，20只)：從實(shí)驗(yàn)開始1~9周直到取材日不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。安靜中藥組(組2，20只)：從實(shí)驗(yàn)開始1~9周直到取材日不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。訓(xùn)練對(duì)照組(60只)：從實(shí)驗(yàn)開始1~9周進(jìn)行上述建模游泳訓(xùn)練，直至第10周取材日隨機(jī)進(jìn)行分組，包括訓(xùn)練前安靜狀態(tài)組(組3a)、訓(xùn)練后即刻狀態(tài)組(組3b)、訓(xùn)練結(jié)束后3 h恢復(fù)狀態(tài)組(組3c)。訓(xùn)練加中藥組(60只)：從實(shí)驗(yàn)開始1~9周進(jìn)行上述建模游泳訓(xùn)練，直至第10周取材日隨機(jī)進(jìn)行分組，包括訓(xùn)練前安靜狀態(tài)組(組4a)、訓(xùn)練后即刻狀態(tài)組(組4b)、訓(xùn)練結(jié)束后3 h恢復(fù)狀態(tài)組(組4c)。

1.3中藥組方和灌藥取材

組方原則：根據(jù)長(zhǎng)期大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練易導(dǎo)致機(jī)體陰陽平衡失調(diào)、氣血耗損、脾腎虛虧，主要采用補(bǔ)血、健脾、活血的中藥：黃芪10 g、白術(shù)10 g、當(dāng)歸8 g、黃精10 g、西洋參10 g、山海螺5 g、蟲草3 g、玉竹10 g等。中藥提取：采用水提取液：取混合好的中藥50 g，紗布包好，加水150 mL于燒杯中浸泡30～60 min，用猛火煮沸后，文火煎30 min，取出過濾，冷卻后定容至100 mL(相當(dāng)于0.5 g/mL生藥)。

灌藥：訓(xùn)練中藥組每日運(yùn)動(dòng)前10 min取2 mL灌胃。訓(xùn)練對(duì)照組大鼠每日運(yùn)動(dòng)前10 min灌胃等體積蒸餾水。安靜對(duì)照組、安靜中藥組大鼠則每日分別灌胃蒸餾水2 mL和2 mL水煎劑。

取材：取材日將各組大鼠斷頸處死，股動(dòng)脈取血，肝素抗凝，分離血漿，-20 ℃冰箱冷藏待測(cè)。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

采用MODEL500(美國(guó)原裝，單泵標(biāo)準(zhǔn)套)液相色譜儀，流量范圍：0.001~10.0 mL/min；精度：0.25%(0.1~10 mL/min)；波長(zhǎng)范圍：190~800 nm；波長(zhǎng)精度：±1 nm。熒光檢測(cè)法檢測(cè)血漿Val、Leu、Ile濃度。基本方法：取血漿加等量乙腈混勻，沉淀蛋白，高速離心13 000 r/min 15 min，取上清液200 μL，加入衍生劑DNFB，于7O ℃水浴中衍生15 min，加磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)至1 mL，離心(12 000 r/min)10 min取上清液進(jìn)樣20 μL，試劑提供為國(guó)產(chǎn)色譜純和美國(guó)Sigm色譜純。

1.5數(shù)理統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包進(jìn)行處理，多組計(jì)量資料采用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)、進(jìn)行析因分析等方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1大鼠血漿Val、Leu和Ile濃度檢測(cè)結(jié)果析因分析

表2結(jié)果顯示，訓(xùn)練和服用中藥對(duì)Leu和Ile的濃度有顯著影響，證實(shí)了Snitinskii等[3]報(bào)道的動(dòng)物在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)、饑餓狀態(tài)下腦與肌肉中亮氨酸等物質(zhì)氧化量會(huì)大幅度增加。但長(zhǎng)時(shí)期運(yùn)動(dòng)和服用中藥對(duì)Val濃度沒有發(fā)現(xiàn)顯著影響，推測(cè)這也許和服用的具體幾味中藥有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。

2.2不同狀態(tài)下大鼠Val、Leu、Ile的測(cè)驗(yàn)結(jié)果

1)安靜狀態(tài)下Val、Leu、Ile變化。

表3結(jié)果顯示，Val、Leu和Ile的濃度在安靜中藥組(組2)中有增高的趨勢(shì)，特別是Leu和Ile的濃度變化明顯，與安靜對(duì)照組(組1)相比差異有非常顯著性。說明施加“復(fù)方補(bǔ)益湯”起到了明顯作用。

2)訓(xùn)練狀態(tài)下Val、Leu、Ile變化。

在訓(xùn)練對(duì)照組與訓(xùn)練中藥組數(shù)據(jù)對(duì)比方面(表4)，訓(xùn)練前安靜狀態(tài)兩組(組3a、組4a)Val無明顯差異，但Leu和Ile訓(xùn)練加中藥組都明顯高于訓(xùn)練對(duì)照組(P<0.01)。訓(xùn)練后即刻狀態(tài)兩組(組3b、組4b)Val、Leu和Ile變化都比較明顯(P<0.05)，訓(xùn)練加中藥組Val、Leu和Ile濃度都高于訓(xùn)練對(duì)照組，證明訓(xùn)練雖然消耗了大量的BCAA，但中藥施加后BCAA稀釋水平下降；在訓(xùn)練結(jié)束后3 h恢復(fù)狀態(tài)兩組(組3c、組4c)Val、Leu和Ile變化也比較明顯(P<0.05)，證明中藥施加后BCAA恢復(fù)水平可得到改善；另外，訓(xùn)練后即刻狀態(tài)與訓(xùn)練結(jié)束后3 h恢復(fù)狀態(tài)數(shù)據(jù)對(duì)比可以直接反映中藥施加是否可以加快BCAA恢復(fù)水平。數(shù)據(jù)顯示，訓(xùn)練結(jié)束后3 h兩組恢復(fù)水平差值中(訓(xùn)練結(jié)束后3 h減去訓(xùn)練后即刻)訓(xùn)練加中藥組均高于訓(xùn)練對(duì)照組，證明施加中藥對(duì)于訓(xùn)練恢復(fù)有積極作用。

3)大鼠力竭狀態(tài)與Val、Leu、Ile變化。

在實(shí)驗(yàn)9、10兩周對(duì)于大鼠運(yùn)動(dòng)至力竭的時(shí)間進(jìn)行了測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練對(duì)照組平均力竭時(shí)間為(6.3±0.7) h，訓(xùn)練加中藥組平均力竭時(shí)間為(7.6±0.5) h，提示中藥施加能推遲力竭運(yùn)動(dòng)到來時(shí)間。在對(duì)力竭訓(xùn)練后3 h Val、Leu、Ile測(cè)定發(fā)現(xiàn)：Leu、Ile指標(biāo)訓(xùn)練加中藥組恢復(fù)水平高于訓(xùn)練對(duì)照組(P<0.05)，Val指標(biāo)訓(xùn)練加中藥組恢復(fù)水平與訓(xùn)練對(duì)照組差異不明顯(見表5)。

3討論

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)游泳訓(xùn)練，大鼠血漿中Val、Leu和Ile的濃度下降，支持了以往研究證明的系統(tǒng)訓(xùn)練可引發(fā)血漿中的支鏈氨基酸水平下降，引發(fā)中樞疲勞的觀點(diǎn)[4]。“復(fù)方補(bǔ)益湯”是中醫(yī)常見的“補(bǔ)益、調(diào)理”方劑，它主要分為補(bǔ)氣、補(bǔ)血、補(bǔ)陰、補(bǔ)陽4大類[5]。大負(fù)荷量運(yùn)動(dòng)能引起機(jī)體能量物質(zhì)的大量消耗，特別是維持骨骼肌合成和中樞穩(wěn)定的氨基酸類物質(zhì)的消耗[6]，這些在祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中都與中醫(yī)的“虛證”相似，屬于“血虛”或“陰虛”范疇。目前已有大量應(yīng)用中藥消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究，但多從“補(bǔ)氣助陽”入手，應(yīng)用“養(yǎng)陰”方法抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的研究報(bào)道還很少。而從中醫(yī)整體觀出發(fā)，陰虛內(nèi)熱也是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞發(fā)生的重要機(jī)制。因此，本實(shí)驗(yàn)從中醫(yī)陰陽互補(bǔ)的角度出發(fā)，貫徹脾為后天之本，氣血生化之源，脾主四肢肌肉，與運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，脾具有維持臟腑的正常機(jī)能與激發(fā)和增強(qiáng)元?dú)獾哪芰ΑＲ虼耍瑥睦碚撋蠎?yīng)辨證施治，推測(cè)選用以補(bǔ)血、補(bǔ)陰類為主的復(fù)方補(bǔ)益藥對(duì)血漿支鏈氨基酸Val、Leu和Ile有積極作用。通過本實(shí)驗(yàn)研究和各項(xiàng)研究數(shù)據(jù)，證實(shí)了理論推測(cè)的真實(shí)性。實(shí)驗(yàn)中藥方劑采用生血、補(bǔ)陰、健脾中藥為主，兼養(yǎng)心安神的方法研制。方中用西洋參、山海螺扶正固本，配黃芪、白術(shù)、山藥、麥冬益氣健脾，酸棗仁養(yǎng)心安神，諸藥互相配合補(bǔ)充和調(diào)節(jié)勞倦可能引起的氣血耗散、脾胃虛虧。現(xiàn)代藥理研究亦證實(shí)，西洋參、山海螺、黃芪等藥除了含有多種營(yíng)養(yǎng)成分外，對(duì)于脾氣虛所致的骨骼肌能量代謝降低有良好的恢復(fù)作用，又可以提高血紅蛋白濃度，改善機(jī)體機(jī)能狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施加“復(fù)方補(bǔ)益湯”大鼠訓(xùn)練后即刻到3 h這段時(shí)間上來看，血漿中纈氨酸(Va1)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)濃度呈下降的趨勢(shì)，其中Leu下降原因推測(cè)是由于亮氨酸是生酮氨基酸，它可以生成乙酰乙酸。運(yùn)動(dòng)負(fù)荷使采用氧化酮體供能比重增加，引起亮氨酸濃度下降。有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)動(dòng)負(fù)荷時(shí)體內(nèi)肌酸和卟啉產(chǎn)生增加，這是導(dǎo)致其主要前體甘氨酸在血漿中濃度下降的原因之一[7]，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷時(shí)血液中糖皮質(zhì)激素濃度增加，而糖皮質(zhì)激素能使Leu轉(zhuǎn)氨酶活性增高。因此，血漿中Leu運(yùn)動(dòng)負(fù)荷后下降。此外，負(fù)荷時(shí)體內(nèi)大量合成兒茶酚胺等激素亦會(huì)影響到Leu濃度。至于Va1和Ile的變化原因推測(cè)是由于和合成異亮氨酸的原料蘇氨酸和合成纈氨酸的原料丙氨酸有直接關(guān)系。

在安靜狀態(tài)下施加“補(bǔ)益湯”大鼠亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)增加明顯，運(yùn)動(dòng)后3 h這兩項(xiàng)指標(biāo)恢復(fù)也比對(duì)照組快，說明“補(bǔ)益湯”能明顯改善大鼠血漿亮氨酸類物質(zhì)水平，從而提高了大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。但是，纈氨酸(Va1)服藥前后變化不明顯，其原因有待進(jìn)一步研究。在對(duì)于力竭訓(xùn)練持續(xù)時(shí)間與力竭后3 h指標(biāo)水平測(cè)試后發(fā)現(xiàn)，中藥施加組大鼠力竭時(shí)間普遍大于對(duì)照組，說明大鼠抗疲勞能力有所加強(qiáng)。力竭后3 h Leu和Ile濃度中藥施加組明顯高于對(duì)照組，說明大鼠在“補(bǔ)益湯”的作用下機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定型增強(qiáng)，促進(jìn)了疲勞的恢復(fù)能力。

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[編輯：鄭植友]