ＨＰＬＣ－ＤＡＤ測定不同來源滇白珠根中木脂素苷含量

摘 要：目的：測定不同來源滇白珠根中木脂素苷含量，進一步探討滇白珠質量標準的制定。方法：HPLC-DAD聯用檢測技術。色譜柱：Kromasil C18，流動相為甲醇-乙腈-0.1%TFA(25∶5∶70)；檢測波長220nm，流速0.7 ml/min，柱溫為25℃，外標法定量。結果：進樣量與峰面積線性關系良好(D₂、D₃均為 r=0.9999)。D₂平均回收率為100.8%，RSD 2.4%。比較不同產地藥材木脂素苷D₂、D₃含量，遵義樣品D₂含量最高，而廣西幾乎不含D₂，但D₃含量最高。不同月份藥材木脂素苷D₂、D₃含量呈一定趨勢變化，其中10月和3月的木脂素苷D₂、D₃含量較其他月份高。結論：此方法簡便、可靠，可以作為評價滇白珠質量的參考方法。

關鍵詞：滇白珠；HPLC-DAD；木脂素苷；含量測定

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-041-03

滇白珠〔Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata(Kurz) T.Z.Hsu〕為杜鵑花科植物滇白珠的全株或根，廣泛分布于我國西南地區和華南地區；《中藥大辭典》和《中國民族藥志》均有記載。它具有祛風除濕、活血化瘀、通絡止痛、清熱解毒等功效，用于治療風濕性關節炎、關節腫痛、跌打損傷、慢性氣管炎和風寒感冒等癥^[1，2]。一般認為水楊酸甲酯是可能的有效成分，但馬小軍等人通過建立和改進分析木脂素苷的高效液相法^[3，4]，研究了滇白珠不同來源^[4]、不同季節、不同地區^[5]、不同白珠樹屬^[6]的木脂素苷含量，建議暫用滇白珠木脂素苷含量作滇白珠的質量標準。近年來HPLC-DAD聯用檢測技術因其具有高靈敏度和高選擇性，已被廣泛運用于多組分定性、定量和純度檢測。本文記載了利用此技術測定的7個不同地區，11個不同月份滇白珠根的木脂素苷含量，進一步探討了滇白珠質量標準的制定。

1 儀器與試藥

Agilent 1100 series高效液相色譜儀(真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD二級管陣列檢測器、HP 1100 3D化學工作站，美國安捷倫科技有限公司)；AG258電子天平(METTLE TOLEDO)；KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；四孔電子恒溫水浴鍋(上海金橋科析儀廠)。木脂素苷(+)-lyoniresinol-2α-O-α-L-arabinopyranoside(D₁)，(-)-5-甲氧基異落葉松樹脂醇-2α-O-β-D-吡喃木糖苷(D₂)，(-)-異落葉松樹脂-2α-O-β-D-吡喃木糖苷(D₃)均為自制，純度>99%。

甲醇(色譜純，Merck公司)、乙腈(色譜純，Dima公司)、三氟乙酸(TFA，分析純，Schartau chemie.S.A公司)、水為樂百氏純凈水，用時經0.45μm微孔濾膜過濾。

不同地區和不同時間的滇白珠藥材均為當地采集或當地藥材市場購買，由貴陽中醫學院孫慶文老師鑒定，其中廣西樣品為Gaultheria leucocarpa Bl.var.cumingiana(Vidal.)T.Z.Hsu 的根，其余16個樣品均為Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata(Kurz) T.Z.Hsu的根。17個樣品標本存于中國科學院天然產物化學重點實驗室(位于貴州省)。

2 方法

(1)色譜條件。色譜柱：Kromasil C₁₈(0.46cm×25cm，5μm)，流動相為甲醇-乙腈-0.1% TFA(25∶5∶70)；檢測波長220nm，流速0.7ml/min，柱溫為25℃，外標法定量。

(2)對照品溶液的制備。精密稱取對照品D₁ 5.01mg，D₂ 4.97mg，D₃ 5.03mg放于5ml的量瓶中，加3ml甲醇加熱溶解，待冷卻，用甲醇定容至刻度。取混合對照品1ml定容于10ml容量瓶中，得約0.1mg/ml混合對照品液。

(3)供試品溶液的制備。精密稱取粉碎后經過40目篩的干燥樣品0.5g，加入30%甲醇25ml，稱重，90℃水浴回流2h，冷卻至室溫，補足減輕的重量，離心，取上清液過0.45μm微孔濾膜，得供試品溶液。按上述色譜條件吸取樣品20μl進樣，按峰面積計算含量。

(4)標準曲線繪制。吸取約0.1mg/ml濃度的D₂，D₃和D₁混合對照液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0和10.0μl，按上述色譜條件測峰面積。以混合標準液進樣量(μg)為橫座標(X)，峰面積為縱座標(Y)，峰面積對濃度進行回歸計算。D₂，D₃，D₁的回歸方程分別為Y₂=5326.6X-24.497，Y₃=5414.9X-56.376，Y₁=3351.3X+50.364；r值分別為0.9999，0.9999，0.9999；線形范圍分別為0.0994~0.994μg，0.1006~0.6036μg，0.1002~0.6012μg。

(5)精密度試驗。取約0.1mg/ml混合對照品溶液，連續進樣6次；D₂，D₃和D₁峰面積的RSD值分別為1.79%，1.08%，1.65%，結果表明方法精密度良好。

(6)重現性試驗。取貴陽2007年3月樣品，按2.3項方法，分別制備6份供試品溶液，測定木脂素苷成分D₂，D₃的峰面積，其RSD值分別為0.83%，4.3%，結果表明方法重現性良好。

(7)穩定性試驗。精密吸取重現性試驗中第二份樣品溶液，于0h，1h，2h，4h，8h，12h測定木脂素苷成分D2，D3的峰面積，其RSD值分別為1.03%，3.69%，結果表明樣品在12h內穩定。

(8)加樣回收率。取貴陽2007年3月樣品6份，每份約0.5g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.5486mg/ml的D₂對照品溶液1ml，按“2.3”項下方法，制備供試品溶液，測定D₂的含量，并計算加樣回收率(表1)。

3 樣品分析

(1)三個木脂素苷波長的選擇。通過DAD檢測器全掃描，并同時觀察其UV圖譜(如圖1)。

D₂對照品

D₃對照品

D₁對照品

圖1 對照品UV圖譜

可以得出三個木脂素苷的最大吸收峰在206nm左右并且275nm處有一寬峰，因206nm靠近末端吸收，而275nm處是一寬峰且峰面積較小，故選定峰面積較大且受末端吸收影響較小的220nm作為測定波長。

(2)樣品分析。取貴陽(2007年3月)、遵義、興義、都勻、安順、云南、廣西7個地區和貴陽地區11個月份樣品，按“2.3供試品溶液的制備”制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1色譜條件”測定樣品，按峰面積計算木脂素苷D₂、D₃含量。從圖2中可看出，D₁在樣品中含量很低。

對照品

貴陽樣品(2007年3月)

圖2 對照品和樣品HPLC色譜圖

(3)11個不同月份木脂素苷D₂、D₃含量比較。由圖3顯示，2006年10月和2007年3月的木脂素苷D₂、D₃含量高于其他月份，這與植物的生長周期相符。

圖3 不同月份木脂素苷D₂、D₃含量

注：1～5表示貴陽樣品采集的時間依次為2006年8～12月，6～9表示時間為2007年1～4月，13～14表示時間為2007年8月、9月。

(4)7個不同地區木脂素苷D₂、D₃含量比較(圖4)。圖4顯示：遵義樣品D₂含量最高，而廣西幾乎不含D₂，但D3含量最高。

圖4 不同地區木脂素苷D₂、D₃含量

4 討論

(1)提取條件的選擇。文獻曾報道用30%甲醇作為提取溶劑，本試驗比較了甲醇，75%乙醇，30%甲醇三種溶劑，證實30%甲醇較前兩者提取效率高。本試驗還比較了超聲30min與水浴回流2h兩種提取方法，得出水浴回流優于超聲提取。

(2)分離條件的選擇。本試驗選擇了Kromasil C18(0.46cm×25cm，5μm，E25864)，Hypersil C18(0.4cm×25cm，5μm，2104268)，Aglient Hypersil ODS(0.46cm×25cm，5μm，lot 4814)三種色譜柱，及0.4%醋酸、0.1%磷酸、0.1%TFA三種酸以及各種比例作流動相進行等度洗脫和梯度洗脫試驗，結果表明Kromasil C18(0.46cm×25cm，5μm)，流動相為甲醇-乙腈-0.1% TFA(25：5：70)；檢測波長220nm，流速0.7ml/min，柱溫為25℃，能使D₁、D₂、D₃完全達到基線分離。

(3)文獻曾報道D₁、D₂、D₄易獲得并測定了上述三種對照品含量，但作者從貴陽2006年8月滇白珠根莖中僅分離得到D₁、D₂、D₃，并且發現17個樣品中D₁含量都極少，難于定量，故在重現性試驗及穩定性試驗中未涉及。

(4)本試驗比較了貴陽2007年3月樣品的根，莖、葉三部分木脂素苷D₂、D₃含量，發現根與莖的含量相當，但葉含量幾乎沒有。

參考文獻：

[1] 江蘇新醫學院.中藥大辭典(下)[M].上海：上海人民衛生出版社，1977：1879.

[2] 衛生部藥品生物制品檢定所.中國民族藥志[M].北京：人民衛生出版社，1992：556.

[3] 張治針，果德安，李長齡，等.高效液相色譜法測定滇白珠木脂素苷的含量[J].中國中藥，1999，24(3)：164.

[4] 趙玉娟，韓振泰，王文芝，等.高效液相色譜法測定滇白珠植物中滇白珠甙[J].分析化學，2002，9(30)：1109.

[5] 馬小軍，趙鈴，趙玉娟，等.不同來源滇白珠木脂素苷含量的研究[J].中國中藥，2002，27(1)：25.

[6] 馬小軍，趙鈴，趙玉娟，等.不同地區和季節對滇白珠中木脂素苷含量的影響[J].中草藥，2002，33(4)：353.

[7] 馬小軍，趙玲，韓振泰，等.白珠樹屬5種藥用植物木脂素苷含量的比較[J].植物資源與環境學報，2002，11(2)：61.

(責任編輯：王尚勇)

Determination of Lignan Glycosides in

Gaultheria leucocarpa by HPLC-DAD

Xie Hong1，2，Yang Juan2，WANG Dao-ping2

(1.The Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001.Guizhou，China；

2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and

Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，Guizhou，China)

Abstract：Objective：The contents of lignans in Gaultheria leucocarpa from seven regions and eleven months were detected to control the quality of Gaultheria leucocarpa.Method：HPLC-DAD was adopted using Kromasil C18 column，methanol：acetonitrile：0.1%TFA-water(25：5：70) as mobile phase，the flow rate was 0.7 ml/ min，the detection wavelength and column temperature were 220nm and 25℃，respectively.Results：There was a good liner relationship between injected volume and peak area.The average recovery of D2 was 100.8%，and RSD was 2.4%.Comparing the content of lignans in Gaultheria leucocarpa from seven regions，Zunyi showed the highest content of D2(74.2 mg/100 g)，and that of Guangxi was little.But the content of D3 in Guangxi sample was highest.To observe the tendency of the content of D2，D3 in Gaultheria leucocarpat from eleven months，it was higher than other months in October and March.Conclusion：The method has been proved to be accurate，reproducible and of higher recovery rate.

Key words：Gaultheria leucocarpa；HPLC-DAD；contents of the lignan glycosides