高效液相色譜／質譜聯用法測定銀黃顆粒中綠原酸含量

摘 要：目的：建立高效液相色譜-電噴霧質譜(HPLC/ESI/MS)聯用測定銀黃顆粒中綠原酸含量。方法：以質譜定性，高效液相色譜定量進行檢測，檢測波長327nm。所用的色譜柱為Spherigel C18色譜柱(200 × 4.6 mm，5m)流動相為乙腈-0.4%磷酸水。結果：在該色譜條件下，綠原酸的含量在1.56g/mL~25g/mL范圍內線性關系良好，相關系數為：r=0.9992，加樣回收率為99.7%，RSD為2.63%(n=5)，最低檢出限為0.05g/mL。結論：該方法操作簡單，分離度好，適用于銀黃顆粒及其提取物中綠原酸含量的測定。

關鍵詞：高效液相色譜/質譜法(HPLC/MS)；綠原酸；銀黃顆粒

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-038-03

銀黃顆粒是由金銀花、黃芩兩味藥材加工制成的復方制劑，具有清熱、解毒、消炎的功效^[1]，主要用于急慢性扁桃體炎、急慢性咽喉炎、上呼吸道感染等癥。金銀花(Flos lonicerae)為忍冬科(Caprifoaceae)忍冬屬(Lonicera)植物，是本方的主藥之一^[2]。金銀花的活性成分之一為綠原酸(結構式如圖1)。綠原酸為咖啡酰奎尼酸衍生物，由奎尼酸和咖啡酸縮合而成，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑，微溶于乙酸乙酯，難溶于三氯甲烷、乙醚、苯等親脂性溶劑，是一種重要的生理活性物質。綠原酸為抗菌消炎的主要成分，對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、痢疾球菌、傷寒桿菌、肺炎球菌有顯著的抑制作用；有抗病毒、升高白細胞、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等作用；與人體血小板凝集和凝血因子的生成有關，還具有抗生育作用及對免疫系統的調節作用^[3，4]。

銀黃顆粒中主藥金銀花的有效成分綠原酸的含量測定主要采用高效液相色譜法^[5，6]，本文采用高效液相色譜/質譜聯用法，對銀黃顆粒中綠原酸的含量進行測定。以期提高銀黃顆粒質量標準可控性，為進一步完善該制劑的質量標準提供實驗依據。

圖1 綠原酸結構式

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液相色譜-質譜聯用儀：Waters 2695-Micromass ZQ 2000質譜檢測器(含四元低壓泵、自動進樣器、單級四極桿質譜檢測器、Masslynx工作站、電噴霧電離源ESI)；KQ 3200 B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

銀黃顆粒(河北省某廠生產)；綠原酸標準品(購自中國藥品生物制品檢定所)；甲醇，丙酮，無水乙醇，磷酸均為分析醇，乙腈為色譜純；二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件

色譜條件：色譜柱Spherigel C18 色譜柱(200×4.6mm，5m)(大連江申分離科學科技公司)，流動相：乙腈-0.4%磷酸水，梯度程序見表1。檢測波長327nm，進樣量10L；流速：1mL/min。

2.2 質譜條件

質譜條件：用電噴霧離子化負離子采集模式(ESI-)，m/z范圍：60～800m/z，毛細管電壓：3.2kV，錐孔電壓：20V，萃取電壓：4V，射頻電壓：0.5V，源溫度：102℃，脫溶劑溫度：300℃，脫溶劑氣流速：280L/h；錐孔反吹氣流速：60L/h；由DAD流出的溶液經過三通閥分流，以0.2ml/min進入到MS電離源。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥10h以上的綠原酸對照品2.5mg，置50ml棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(綠原酸含量50g/ml)。

2.4 供試品溶液的制備

用碾缽將銀黃顆粒磨成細小粉末，精確取0.5416g樣品，置50ml棕色容量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取30min使溶解，放冷至室溫，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.5 線性范圍和檢測限

分別取50g/mL綠原酸標準品用甲醇配制成，12.5g/mL，6.25g/mL，3.13g/mL，1.56g/mL的系列標準品，過0.45m膜后，按2.1色譜條件每個濃度的標準品進樣3次，記錄峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標得到綠原酸的標準曲線方程為：

y=725.42x-268.21，線性范圍：1.56g/mL~25g/mL，相關系數r=0.9992

將綠原酸標準溶液逐級稀釋后，測得最低檢測限為0.05μg/mL(S/N=3)；最低定量限為0.2μg/mL(S/N=10)。

2.6 HPLC/ESI/MS分析

綠原酸的分子式為C₁₆H₁₈O₉，相對分子質量為354.30。按2.1色譜條件，得到了對照品和銀黃顆粒樣品色譜圖(圖2)，綠原酸的相對保留時間為9.78min左右。圖3為選擇離子m/z353質譜圖。

A

b

圖2 HPLC色譜

a.對照品色譜圖；b.銀黃顆粒樣品色譜圖

a

b

圖3 質譜

a.綠原酸對照品質譜圖；b.銀黃顆粒樣品質譜圖

m/z 353是綠原酸分子失氫后形成的準分子離子[M-H]-，m/z708為二聚物脫氫形成的碎片離子，m/z191為酯鍵斷裂脫去咖啡酰基生成[M-caffeoyl]-碎片離子，這些推測結果與譜圖上所反映的信息基本一致。隨著錐孔電壓升高，總離子流響增強，分子離子峰的強度降低，當電壓升到20V時，準分子離子峰強度最強。所以在選擇離子模式中，錐孔電壓設為20V。

2.7 精密度和回收率試驗

取25g/mL綠原酸標準溶液，按2.1色譜條件連續進樣6次，每次進樣10L，以峰面積計算相對標準偏差，結果為RSD=1.44%(n=6)。

取5份已知含量的銀黃顆粒樣品0.5g左右，精密稱定，分別加入50g/mL標準品1.00mL，按樣品處理的方法，以50%甲醇超聲提取30min，過濾，過膜，按2.1色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率，得平均回收率為99.7%，RSD為2.63%(n=5)。

2.8 重復性試驗

取銀黃顆粒樣品0.5g左右6份，精密稱定，以50%甲醇超聲提取30min，過濾，過膜，按2.1色譜條件測定峰面積，計算各組分綠原酸含量，結果RSD=2.12%(n=6)，表明重復性好。

2.9 樣品分析

取2.4制備的待測液過0.45m膜后，按2.1色譜條件進樣測定，平行進樣5次，積分求峰面積，根據回歸方程，求得到綠原酸的平均含量為5.13mg/g。

2.10 提取條件的選擇

分別加入40%、50%、70%甲醇，50%、70%丙酮，40%、50%、70%乙醇，冷水和熱水，分別定容至50mL，超聲30min，過0.45m膜，備用進樣。不同溶劑提取的綠原酸含量(見表2)，由表可知，40%甲醇的提取效果最好，而綠原酸在水中的溶解度低，水提取的效率較低。

比較乙醇與甲醇提取效果，當乙醇濃度達到70%時，提取率跟40%甲醇接近。考慮到甲醇的成本和毒性，實驗可以選取70%乙醇進行超聲提取。雖然綠原酸易溶于丙酮，70%丙酮和50%丙酮提取的樣品含量與甲醇提取的樣品結果相近，說明丙酮提取方法可行。但由于丙酮的微毒性、直接進樣丙酮的溶劑峰干擾較大，蒸干后再溶解進樣操作復雜，因此不宜使用丙酮作為提取溶劑。

采用上述分析方法，比較提取時間的影響，發現30min提取比較完全，超聲40min或45min，綠原酸的含量反而降低。這是由于綠原酸穩定性差，超聲時間過長，或超聲溫度過高，會引起綠原酸分解，所以選取超聲30min提取銀黃顆粒中綠原酸的含量。

3 結論

本文采用高效液相色譜配合質譜的聯用，總結了中成藥制劑中綠原酸含量的測定方法，該方法具有靈敏度高、抗干擾能力、強定性定量準確等特點。同時對提取溶劑的選擇進行了研究，結果發現70%乙醇進行超聲提取30min，與甲醇提取效果相當，可以節約測試成本。

參考文獻：

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[4] 崔曉燕，王素霞，候永利.金銀花提取物的抗炎機制研究[J].中國藥房，2007，18(24)：1861-1863.

[5] 劉文麗.HPLC法測定銀黃顆粒中綠原酸的含量[J].安徽醫藥，2007，11(8)：711-712.

[6] 魏清，康紅英.效液相色譜法測定銀黃顆粒中綠原酸的含量[J].時珍國醫國藥，2007，18(7)：1689-1670.

(責任編輯：萬賢賢)

Determination of Chlorogenic Acid in Yinhuang Granules by HPLC/MS

Ding Fanglin1，Peng Shulian2

Abstract：Objective：A simple and rapid high performance liquid chromatograptic/mass spectrum has been developed for the determination of Chlorogenic acid in Yinhuang granules.Methods：It is separated by a Spherigel C18 column(200×4.6mm，5m)with a mobile phase of acetonitril —H2O(with 0.4% phosphate acid).The detection wavelength is 327 nm.Results：Under the chromatographic conditions mentioned above，the method performance，such as the number of theoretical plate，resolution，trailing etc have all reached the required level.The linear range for chlorogenic acid standard is 1.56g/mL~25g/mL，and the correlation coefficients is 0.9992.The average recoveries is 99.7%.The minimum detection limit of chlologenic acid is 0.05g/mL.Conclusion：The method is suitable for the determination of chlorogenic acid in Yinhuang granules and related products.

Key words：HPLC/MS；Chlorogenic acid；Yinhuang granules