痛經靈顆粒質量標準的研究

摘 要：目的：對痛經靈顆粒進行質量標準研究。方法：采用薄層色譜法對痛經靈顆粒進行定性鑒別；采用高效液相色譜法對痛經靈顆粒中的丹酚酸B進行含量測定。結果：丹酚酸B的線性范圍分別為0.264～1.584g，平均回收率為100.65%。結論：方法可行、重復性好，能有效地控制痛經靈顆粒的質量。

關鍵詞：痛經靈顆粒；質量標準

中圖分類號：R286.0 文獻標識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-034-04

痛經靈顆粒為《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第15冊收載品種^[1]。功能與主治為活血化瘀，理氣止痛；用于氣滯血瘀所致痛經。原質量標準中只收載了兩個顯色沉淀鑒別反應，無薄層鑒別項目，無含量測定項目，不利于藥品質量控制。我們經過研究，增加了丹參、赤芍及元胡的薄層鑒別項目，并增加了高效液相色譜法測定處方中丹酚酸B的含量項目，以對原質量標準進行提高，進一步有效控制痛經靈顆粒產品質量。

1 儀器和材料

1.1 試驗儀器

P200Ⅱ高效液相色譜儀：大連依利特科學儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

對照品及對照藥材購于中國藥品生物制品檢定所；所用試劑均為分析純或色譜純；痛經靈顆粒(自制)。

2 實驗方法和結果

2.1 定性鑒別^[2]

2.1.1 丹參的薄層色譜鑒別

取本品3g，加水40ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)鹽酸溶液5ml，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加75%甲醇使溶解并定容至2ml，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對照品，加75%甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取不含丹參的其它藥材照本品制備工藝和供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各6μl，對照品溶液10μl，分別點于同一硅膠GF254薄層板(以等量4%磷酸氫二鈉溶液與0.4%羧甲基纖維素鈉溶液的混合溶液為粘合劑制備)上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性無干擾。用連續生產的20060101、20060102、20060103三批中試樣品進行驗證，結果均檢出了丹酚酸B，如圖1。此法簡單、靈敏度高、重現性好、專屬性強。

1，2，3為三批樣品；4為丹酚酸B對照品；

5為缺丹參的陰性樣品

圖1 痛經靈顆粒中丹參的TLC(熒光)

2.1.2 赤芍的薄層色譜鑒別

取本品10g，研細，加70%乙醇100ml，超聲處理 30win，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30ml，棄去水液，正丁醇液蒸至約1ml，加中性氧化鋁2g，在水浴上拌勻，干燥，裝入中性氧化鋁小柱(100～200目，2g，內徑10～15mm)上，用乙酸乙酯-甲醇(1∶1)混合溶液50ml洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加乙醇1ml使溶解，上清液作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每 1ml含 2mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取不含赤芍的其它藥材照本品制備工藝和供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述三種溶液各 10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2) 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的藍紫色斑點；陰性無干擾。如圖2。此法簡單、靈敏度高、重現性好、專屬性強。

1，2，3為三批樣品；4為芍藥苷對照品；5為缺赤芍的陰性樣品

圖2 痛經靈顆粒中赤芍的TLC1(日光)

2.1.3 元胡的薄層色譜鑒別

取本品10g，研細，加水20ml使溶解，加濃氨試液調至堿性，用乙醚提取3 次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取延胡索對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取不含元胡的其它藥材照本品制備工藝和供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液10μl，對照藥材溶液10μl，對照品溶液2μl，分別點于同一用1%氫氧化鈉制備的硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇(7.5∶4∶1) 為展開劑，置以展開劑預飽和的展開缸內，展開，取出，晾干，以碘蒸氣熏至斑點顯色清晰。日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈(365nm) 下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性無干擾。如圖3、圖4。此法簡單、靈敏度高、重現性好、專屬性強。

1，2，3為三批樣品；4為延胡索對照藥材；5為延胡索乙素對照品；6為缺元胡的陰性樣品。

圖3 痛經靈顆粒中元胡的TLC1(日光)

1，2，3為三批樣品；4為延胡索對照藥材；5為延胡索乙素對照品，；6為缺元胡的陰性樣品。

圖4 痛經靈顆粒中元胡的TLC1(熒光)

2.2 丹酚酸B含量測定^[2-3]

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)為流動相，檢測波長：286nm。理論板數按丹酚酸B峰計算應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取丹酚酸B對照品適量，加75%甲醇制成每1ml含0.132mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品3.0g左右，精密稱定，加水50ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)鹽酸溶液2ml，用乙酸乙酯振搖提取5次(40、40、40、30、20ml)，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，殘渣加適量75%甲醇使溶解，定容至50ml，即得。

2.2.4 乙酸乙酯提取次數的考察

分別取本品3.0g左右，精密稱定，加水50ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)鹽酸溶液2ml，考察了振搖提取3次、4次、5次、6次的情況。其余操作過程按供試品溶液制備方法制備，分別按正文[含量測定]項下方法操作，進樣量為10μl，測定峰面積值并比較結果，根據乙酸乙酯提取結果，提取5次峰面積，且提取6次峰面積與提取5次無明顯變化，因此，將乙酸乙酯振搖提取次數定為5次。

同時，我們比較了在乙酸乙酯振搖提取次數為5次的情況下，每次振搖提取時加乙酸乙酯量對峰面積大小的影響，提取5次(40、40、40、30、20ml)和提取5次(40、40、40、40、40ml) 峰面積無明顯變化；因此，將乙酸乙酯振搖提取定為5次(40、40、40、30、20ml)。

2.2.5 線性關系的考察

分別精密吸取丹酚酸B對照品溶液(C=0.132mg/ml)2、4、6、8、10、12μl分別進樣，記錄色譜圖，測定各峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(Y)，進樣量為橫坐標(X)，求得回歸方程Y=14949.64X+44.61，r=0.9998。說明丹酚酸B在0.264～1.584g范圍內，進樣量與丹酚酸B峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.2.6 專屬性試驗

參照痛經靈顆粒制備工藝制得缺丹參藥材的陰性樣品，同本篇所述的樣品方法處理，得丹酚酸B陰性供試品溶液，按照本篇所述丹酚酸B含量測定方法進行測定，在與丹酚酸B對照品溶液對應的保留時間處，丹酚酸B陰性供試品溶液無吸收峰，表明陰性無干擾，專屬性強。見圖5。

A

B

C

A.陰性對照 B.供試品 C.對照品

圖5 丹酚酸B含量測定HPLC

2.2.7 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液各10μl，按本篇〔樣品測定〕項下方法操作，按0、2、4、6、8h時間間隔分別進樣，測定色譜峰面積，測得峰面積積分值，丹酚酸B峰面積值的RSD值為0.37%，試驗結果表明，樣品供試液在8小時內穩定性良好。

2.2.8 精密度試驗

取同一供試品溶液，分別精密吸取10μl，連續進樣5次，測定譜峰面積，丹酚酸B峰面積值的RSD值為0.88%，試驗結果表明，精密度良好。

2.2.9 重復性試驗

取同一批號樣品(批號20060101)五份，按供試品溶液制備方法制備，分別按本篇[含量測定]項下方法操作，進樣量為10μl，測定峰面積值并計算含量，RSD值為1.12%，試驗結果表明，重復性良好。

2.2.10 回收率試驗

取樣品(批號20060101)約1.5g，精密稱定，加水分別為35、25、15ml使之溶解，分別精密加入丹酚酸B對照品溶液(C=0.126mg/ml )15、25、35ml，平行做兩份，其它步驟按供試品溶液制備方法制備，按本篇[含量測定]方法操作，進樣量為10μl，以下列公式計算回收率，測定結果見表1。

試驗結果表明：回收率在96.2%～103.1%之間，加樣回收良好。

2.2.11 樣品測定

取本品三批中試樣品和十批小試樣品各約3g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制得供試品溶液，按本篇[含量測定]方法操作，每次進樣量為10μl，測定結果見表2和表3。

3 討論

(1)對本品的薄層色譜鑒別均作了陰性對照試驗，陰性無干擾，結果表明此法簡單、靈敏度高、重現性好、專屬性強，可作為本品定性鑒別的依據。

(2)丹參為方中君藥，它的主要化瘀止痛有效成分為丹酚酸B，經過藥味和含量測定方法篩選，我們選擇丹參中的有效成分丹酚酸B作為含量控制項目，進行含量測定，此法具有分離效果好、靈敏、準確等優點。

(3)在痛經靈顆粒中試生產中，我們投料用的丹參藥材丹酚酸B含量為3.2%，根據三批中試和10批小試樣品測定結果，痛經靈顆粒丹參含量以丹酚酸B計為2.112mg/g左右。按此平均含量下浮20%計算，痛經靈顆粒成品每克含丹參量以丹酚酸B計應為1.69mg/g左右；同時，考慮到藥材的來源，以及制劑生產過程、貯藏等因素影響，故暫定本品每克含丹參量以丹酚酸B(C₃₆H₃₀O₁₆)計，不得少于1.4mg，且每袋裝25g，故暫定本品每袋含丹參量以丹酚酸B(C₃₆H₃₀O₁₆)計，不得少于35.0mg。

參考文獻：

[1] WS3-B-3008-98.衛生部部頒藥品標準(第15冊)[S].

[2] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：化學工業出版社，2000.

[3] 謝秀瓊主編.中藥新制劑開發與應用(第二版)[M].北京：人民衛生出版社，2003.

(責任編輯：陳涌濤)