免疫佐劑研究進(jìn)展

摘 要：隨著疫苗研究的飛速發(fā)展，如重組DNA疫苗、合成肽段疫苗等，免疫佐劑的研究越來越受到人們的關(guān)注。佐劑可以導(dǎo)致快速而強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。分析了常用佐劑的應(yīng)用及其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，并綜述了兩種新型的免疫佐劑的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：免疫；佐劑；疫苗

中圖分類號：R392.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1673-2197(2008)04-025-03

早在70年前，免疫佐劑就被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)和研究。佐劑與特異性免疫原本無關(guān)，但可非特異性地通過物理的或化學(xué)的方式與特異性免疫反應(yīng)物質(zhì)結(jié)合，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體保護(hù)能力，同時能減少抗原的用量，節(jié)約成本。隨著疫苗研究的不斷深入，特別是分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，研制出的新型基因工程疫苗純度高、特異性強(qiáng)，但分子小，免疫原性相對較差，難以產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，需要佐劑來增強(qiáng)其免疫原性或宿主對抗原的保護(hù)性應(yīng)答。本文就常用佐劑以及最近深入研究、比較的兩種免疫佐劑的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 常用免疫佐劑

1.1 鋁鹽佐劑

鋁鹽是一種含有Al3+的無機(jī)鹽，主要有Al(OH)₃、AlPO₄等。鋁鹽佐劑的應(yīng)用非常廣泛，是現(xiàn)在唯一被FDA批準(zhǔn)的人、獸均可應(yīng)用的佐劑。鋁鹽與抗原結(jié)合形成抗原貯存庫，使抗原得以緩慢穩(wěn)定地釋放。鋁鹽的應(yīng)用已有八十年的歷史，實(shí)踐證明是一種有效的誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的佐劑，而且氫氧化鋁成本低廉，使用方便、無毒，是胞外繁殖的細(xì)菌及寄生蟲抗原的良好免疫佐劑。但它也存在明顯的缺陷，主要的不足之處是鋁鹽佐劑僅能誘導(dǎo)、激發(fā)體液免疫，對由胞內(nèi)病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)等引起的病毒性疾病無法產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫^[1]。

1.2 氟氏佐劑

氟氏佐劑分為氟氏完全佐劑(FCA)和氟氏不完全佐劑(FIA)兩種。FCA是在FIA的基礎(chǔ)上加一定量滅活的分枝桿菌而成的，是Th1亞型細(xì)胞強(qiáng)有力的激活劑。FCA既能刺激體液免疫，還是細(xì)胞免疫的強(qiáng)刺激劑。FIA則僅刺激體液免疫。但弗氏佐劑在使用中可引起慢性肉芽腫和經(jīng)久不愈的潰瘍，造成嚴(yán)重的組織損傷。Wagland等^[2]實(shí)驗(yàn)證明：在用FCA作為佐劑為豬做免疫時，盡管產(chǎn)生了較高的抗體滴度，卻降低了免疫效果。弗氏佐劑的代表性替代品有乳膠類佐劑Ribi和Titer Max，采用了可代謝和無毒的鯊烯作為油劑，以減輕炎癥反應(yīng)。但其實(shí)驗(yàn)效果并不穩(wěn)定^[3]。除少數(shù)獸用疫苗如口蹄疫疫苗使用FIA外，很少用于動物免疫，更不能用于臨床醫(yī)學(xué)。

1.3 脂質(zhì)體佐劑

脂質(zhì)體是一層或多層脂質(zhì)雙分子膜以同心圓形式包封而成，兼具佐劑和載體功能，類似細(xì)胞膜的微球體。脂質(zhì)體能將抗原傳遞給合適的免疫細(xì)胞，具有靶向作用。脂質(zhì)體無毒、無免疫原性，且在體內(nèi)可降解，是一種較良好的佐劑。在細(xì)菌類、病毒類、寄生蟲類以及腫瘤類脂質(zhì)體疫苗的開發(fā)中有許多相關(guān)報道證實(shí)了它的有效性。由N’，N’—二甲基乙二胺基氨甲酰基膽固醇(DC-chol)制備成的正電荷脂質(zhì)體作為基因轉(zhuǎn)移的載體而被批準(zhǔn)用于基因治療的臨床研究。這種正電荷脂質(zhì)體的表面吸附帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)疫苗，增強(qiáng)了疫苗的免疫原性，且其成份簡單，制備方便，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，安全無毒，可望在不久的將來成為繼鋁佐劑后又一種被批準(zhǔn)用于人類疫苗的新型佐劑^[4]。易學(xué)瑞等^[5]用DC-chol制備粒徑為50~300nm的正電荷納米脂質(zhì)體，作為乙肝疫苗的佐劑，免疫小鼠后進(jìn)行血清中特異型抗體IgG1、IgG2、脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的測定。結(jié)果表明，該制劑誘導(dǎo)的特異性抗體以IgG2為主，能誘導(dǎo)高水平的Th1類的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ，表明納米正電荷脂質(zhì)體將能順應(yīng)疫苗研究的發(fā)展方向，有助于提高蛋白質(zhì)疫苗和基因疫苗的細(xì)胞免疫效應(yīng)。

1.4 免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)

ISCOM是由抗原、皂苷、膽固醇、磷脂組成的疏水性籠狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)使抗原顆粒化，比可溶性的抗原更易被APC吞噬，能同時活化Th細(xì)胞、CTL細(xì)胞、B細(xì)胞。既能激發(fā)細(xì)胞免疫，又可激發(fā)體液免疫，可產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答。用ISCOM技術(shù)制備的各種獸用細(xì)菌、病毒、寄生蟲疫苗已有大量研究。Furrie E等通過給小鼠口飼含卵蛋白(OVA)的ISCOM發(fā)現(xiàn)，小鼠腸相關(guān)淋巴細(xì)胞組織(腸系膜淋巴結(jié)MLN和集合淋巴結(jié)PP)有炎性細(xì)胞募集，即活化的F4/80+巨噬細(xì)胞、活化的樹突細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞及B220+B淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯升高，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清OVA的吸收速度加快，峰值提早，提示ISCOM可通過對抗原攝取和局部輔助細(xì)胞的聯(lián)合影響來增強(qiáng)腸道抗原的免疫原性，具有開發(fā)為粘膜佐劑的前景。

1.5 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫系統(tǒng)分泌產(chǎn)生的小分子多肽。是用于防御外來微生物的主要免疫介導(dǎo)因子和效應(yīng)物質(zhì)。多種細(xì)胞因子都具有免疫佐劑的作用。將編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒與DNA疫苗共注射時，在不同程度上增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果，并可引導(dǎo)免疫向有利的方向轉(zhuǎn)變。目前用于誘導(dǎo)Th1免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子主要是IFN-γ、IL-2、IL-12等，而誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子則是IL-4、IL-6、IL-10等，其中以IL-12的研究最為引人注目。IL-12又稱為細(xì)胞毒性T細(xì)胞成熟因子和自然殺傷細(xì)胞刺激因子。可作用于NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，是連接天然免疫和特異性免疫的橋梁。IL-12能強(qiáng)有力地刺激NK細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ，還可刺激原初CD4+T細(xì)胞分化為Th1亞群，調(diào)節(jié)Th1/Th2型應(yīng)答的平衡，有助于Th1分化優(yōu)勢。同時IL-12還可刺激CD8+T細(xì)胞分化為成熟細(xì)胞^[6]。在寄生蟲，特別是胞內(nèi)寄生蟲的感染中，IL-12具有強(qiáng)大的免疫保護(hù)作用，已經(jīng)在利什曼原蟲、瘧原蟲、弓形蟲和血吸蟲感染的試驗(yàn)中獲取得了一定的效果。

2 兩種新型佐劑的開發(fā)

2.1 CpG佐劑

CpG是一類以CpG二核苷酸為核心的未甲基化的特殊的DNA序列。CpG ODN作為佐劑，可明顯促進(jìn)Thl型免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。其與不完全弗氏佐劑聯(lián)合應(yīng)用時，其效應(yīng)甚至強(qiáng)于完全弗氏佐劑。即使與Th2型佐劑如氫氧化鋁合用亦可明顯促進(jìn)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，且Thl型應(yīng)答明顯強(qiáng)于Th2型應(yīng)答。CpG ODN能直接激活B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等，間接激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞，誘導(dǎo)以Thl型為主的免疫應(yīng)答，是一種高效低毒的免疫佐劑，在基因疫苗、免疫缺陷性疾病、腫瘤、感染性疾病及過敏性疾病的治療中有著強(qiáng)大的潛在應(yīng)用價值。

最初得到的CpG來源于微生物細(xì)菌，而且只有非脊椎動物的DNA具有上述生物活性，脊椎動物和植物的則沒有。進(jìn)一步的研究表明，在細(xì)胞DNA中，CpG基序出現(xiàn)的頻率為1/16，且是非甲基化的，而在脊椎動物基因組中則以1/50~1/60的低頻率表達(dá)，其中80%左右的胞嘧啶被甲基化。如果將細(xì)菌CpG DNA中的胞嘧啶甲基化，則會失去免疫刺激效應(yīng)。

脊椎動物免疫系統(tǒng)識別細(xì)菌CpG DNA的過程認(rèn)為比較經(jīng)典的是NF-κB途徑。天然免疫系統(tǒng)細(xì)胞表面有一種模型識別受體(PRRS)，該受體能與存在于微生物細(xì)胞的分子模型特異性結(jié)合，該類分子模型稱為病原體相關(guān)分子模型(PAMPs)。CpG DNA作為一種PAMP，與細(xì)胞膜上負(fù)責(zé)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Toll樣受體9(TLR-9)特異性結(jié)合，在另一種接頭蛋白即髓樣分化標(biāo)志物88(MyD88)的參與下，將胞外信號傳導(dǎo)至胞內(nèi)，與胞內(nèi)靶物質(zhì)具有絲/蘇蛋白激酶活性的IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)作用，使IRAK磷酸化，繼而與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF6相結(jié)合，通過TRAF6使IRAK連接于NF-κB誘導(dǎo)激酶，使NF-κB通路活化，誘導(dǎo)某些基因的特異表達(dá)^[7]。

這種CpG-DNA/TLR9/MyD88/NF-κB的作用途徑一直被認(rèn)為是CpG作用的主導(dǎo)途徑，但Spies^[8]等的實(shí)驗(yàn)卻否定了這一假設(shè)。他們將CpG基序插入到質(zhì)粒骨架區(qū)觀察表達(dá)OVA的質(zhì)粒的免疫原性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體內(nèi)反復(fù)多次的質(zhì)粒免疫后，OVA特異性CTL的增殖反應(yīng)在DC TLR9+和TLR9-或MyD88-的小鼠中都一樣。這一結(jié)果提示，CpG-DNA與免疫細(xì)胞的作用方式除了CpG-DNA/TLR9途徑外，還可能存在其他模式。

由于CpG DNA的免疫刺激作用存在種屬特異性。國內(nèi)外許多研究者致力于篩選對不同動物最佳免疫刺激性的CpG ODN作為免疫佐劑。景志忠等^[9]通過篩選人工合成多種經(jīng)硫代修飾的CpG ODN序列，對兔、豬、鼠體進(jìn)行了與鋁膠、206佐劑、蜂膠佐劑的配伍和比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，CpG ODN與鋁膠聯(lián)合各組比相應(yīng)單一佐劑組的抗體效價增加顯著，其中，CpG2的優(yōu)越性更明顯。不僅具有強(qiáng)烈刺激體液免疫的功能，而且強(qiáng)烈刺激細(xì)胞免疫。李光富等^[10]設(shè)計(jì)合成了38種CpG ODN，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)篩選出了一種改進(jìn)的CpG ODN18264，與佐劑配合rSj28GST-TrX抗原免疫小鼠，結(jié)果表明，不僅能有效提高抗rSj28GST-TrX抗體的水平，而且能使IgG2a：IgG1的比值顯著增高，有效地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答類型向Th1型轉(zhuǎn)換。

CpG ODN通過硫代化處理克服了在體內(nèi)易降解的缺點(diǎn)，又因其可激發(fā)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，這樣對一些由胞內(nèi)病毒引起的病毒性疾病的免疫顯得尤為重要。一些不能與鋁劑混合的減毒活疫苗或多價疫苗則可用CpG ODN增強(qiáng)免疫原性，同時證明CpG ODN對口服抗原也具佐劑效應(yīng)。由于CpG ODN在研究過程中發(fā)現(xiàn)不僅有種屬的特異性，又因抗原的不同而產(chǎn)生有差異的調(diào)節(jié)效應(yīng)，給其研究帶來了很多麻煩^[11]，但由于其明顯的優(yōu)點(diǎn)及在免疫治療、疾病預(yù)防等方面前景廣闊，許多研究者正致力于將其開發(fā)為一種新型免疫制劑。

2.2 粘膜免疫佐劑CT和LT

粘膜免疫在防御病毒、細(xì)菌等病原體引起的腸道及呼吸道感染中起主要作用，是機(jī)體免疫防御的第一道防線。而粘膜表面特殊的理化性質(zhì)，減弱了粘膜免疫強(qiáng)度，甚至導(dǎo)致免疫耐受。粘膜免疫佐劑活性是CT和LT的重要生物學(xué)活性之一。CT是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由一個毒性A亞基CTA和五個完全相同的B亞基CTB組成，A亞基合成后裂解為CTA1和CTA2，以二硫鍵連接。其中CTA1具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，與CT的佐劑作用密切相關(guān)。LT是由大腸桿菌產(chǎn)毒株合成的一種不耐熱腸毒素，結(jié)構(gòu)與CT類似，也具有特有的ADP-核糖基化活性。LTB和CTB與表達(dá)于細(xì)胞表面的GMI神經(jīng)節(jié)苷脂及其它受體有極高的親和力，在其免疫原性和佐劑作用中扮著重要角色。

CT和LT不論是經(jīng)口服還是鼻腔接種途徑給予，對于特定的蛋白抗原都是非常有效的佐劑。CT是良好的粘膜免疫原，作為佐劑，能提高對多種口服天然抗原的局部粘膜免疫力，特別是在于胃腸道粘膜免疫有極強(qiáng)的免疫原性，可大大提高血液和粘膜IgA的產(chǎn)量。而且LT誘導(dǎo)的粘膜分泌性抗體應(yīng)答并不限于抗原沉積部位，在其他粘膜效應(yīng)部位也有同樣的應(yīng)答發(fā)生，符合共同粘膜免疫系統(tǒng)(C MIS)的理論。CT和LT的作用機(jī)理目前尚不太清楚。研究證明，CT可誘導(dǎo)DC成熟，能提高巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞表面的B7-1和B7-2的表達(dá)，增強(qiáng)其協(xié)同處理的蛋白抗原的CD4+Th2應(yīng)答，引起Th1向Th2轉(zhuǎn)化，而對CD8+T細(xì)胞有強(qiáng)烈的抑制作用，通過TH2型應(yīng)答產(chǎn)生的IgA、IgG、IgM等實(shí)現(xiàn)粘膜免疫^[12][13]。

CT和LT作為口服粘膜免疫佐劑有很好的效果，但其毒性作用嚴(yán)重地限制了其應(yīng)用。研究者追求的應(yīng)該是無毒副作用、高效廣譜的佐劑。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，給CT和LT的應(yīng)用帶來了新的機(jī)遇，使其成為佐劑開發(fā)的新熱點(diǎn)。通過基因工程的方法，對其具有毒性的亞單位通過單個氨基酸的突變可以保留佐劑的性能而減少毒性。當(dāng)前的研究主要是構(gòu)建減毒的突變體和嵌合體，使其具有一定的酶活性而獲得足夠的佐劑活性，同時，酶活性又不至于對人產(chǎn)生可見的毒副作用。Boyaka等^[14]報道，由突變的CTA(mCTA)LTB構(gòu)成的嵌合體mCTA/LTB作為佐劑經(jīng)鼻腔接種后，比其它毒素來源的佐劑產(chǎn)生抗CTB的IgE抗體低得多，具有兩種外毒素的優(yōu)點(diǎn)，是將來用于人類粘膜免疫佐劑的具有優(yōu)勢的侯選者。

3 展望

近年來，免疫佐劑的發(fā)展非常快速，人們通過各種途徑力求尋找一種盡可能達(dá)到最大刺激作用和最小毒副作用的佐劑。佐劑的聯(lián)合使用及發(fā)揮其協(xié)同作用顯得尤為重要。Mccluskie等^[15]聯(lián)合使用LT和CpG ODN作為HBsAg的佐劑免疫小鼠，從特異性系統(tǒng)體液免疫、粘膜體液免疫、T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫及細(xì)胞因子等多方面進(jìn)行評價，證實(shí)了CpG ODN與LTB的協(xié)同作用，推測CpG ODN聯(lián)合保留部分酶促反應(yīng)的LT重組體可能取得最佳免疫放大作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] O’Haagan DT，Mackichan ML，Singh M. Recent developments in adjuvants for vaccines against infectious diseases [J].Biomolecular Engineering，2001，18(3)：69-85.

[2] Waglan BM，McClure SJ，Cosseg SG，et al.Effect of Freund’s adjuvants on guinea pigs infected with，or vaccinated against，Trichost Yongylus colubriformis [J]. Int J Parasitol，1996，26(1)：85-90.

[3] Briand EJ，Ruble GR，Stiteller J，et al.Comparision of adjuvants with leish mania antigens in a guinea pig model to induce delayed-type hypersensitivity response [J].Lab Anim Sci，1999，49(5)：519-521.

[4] Brunel F，Darbouret A.Cationic lipid Dc-chol induces an improved and balanced immunity able to overcome the unresponsiveness to the hepatitis B vaccine [J].Vaccien，1999，17：2192.

[5] 易學(xué)瑞，祖萍，袁有成，等.脂質(zhì)體佐劑對增強(qiáng)HBsAg免疫原性的作用 [J].上海免疫學(xué)，2002，22(6)：395-397.

[6] Yamakami K，Akao S，Sato M，et al. Asingle intraderaml administration of soluble lelishmanial antigen and plasmid expressing interleukin-12 protects BALB/c mice from leishimania major infection [J]. Parasitol Int，2001，50(2)：81-89.

[7] Stefan B，Carsten JK，Hans H，et al.Human TLR9 comfers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition[J]. Proc Natl Aced Sci USA，2001，98：9237-9242.

[8] Spies B，Hochrein H，Vabulas M. Vaccination with plasmid DNA activates dendritic cells via Toll-like receptor 9(TLR-9) but functions in TLR9-deficient mice[J].J Immunol，2003，171：5908-5912.

[9] 景志忠，王佩雅，蒙學(xué)蓮，等.GpG ODN 增強(qiáng)豬囊尾蚴病疫苗免疫反應(yīng)的試驗(yàn)研究[J].中國獸醫(yī)科技，2004，34(2)：3-6.

[10] 李光富，張兆松，朱鴻飛，等.CpG 寡聚核苷酸的篩選及其對Rsj28GST的免疫佐劑作用[J].中國血吸蟲病防治，2004，16(2)：104-108.

[11] Lee SW，Sung YC.Immunostimulatory effects o0 bacterial-derived plasmids depend on the mature of the antigen in intramuscular DNA inoculations [J]. J Immunol，1998，94：285-289.

[12] Jang MH，Kweon MN，Hiroi T，et al .Induction of cytotoxic T lymphocyte responses by cholera toxin treated bone marrow-derived dendritic dells[J].Vaccine，2003，21(15)：1613-1619.

[13] Martin M，Metzger DG，Michalek SM，et al. Distinct cytokine regulation by cholerla toxin and type Ⅱ heatlabile toxins involves differential regulation of CD40 logand on CD+ T Cells[J]. Infect Immun，2001，69(7)：4486-4492.

[14] Boyaka PN，Mari O，Kohtaro F，et al. Chimeras of labile toxin and cholera toxin retain mucosal adjuvanticuty and direct Th cell subsets via their B subunit[J]. J Immunol，2003，170(1)：454-462.

[15] McCluskie MJ，Weerootna RD，Clements JD，et al.Mucosal immunization of mice using CpG DNA and/or matants of heat-labile enterotoxin of Escherichia coli as adjuvants [J]，Vaccine，2001，19(27)：3759-3768.

(責(zé)任編輯：陳涌濤)