病理性瘢痕中結締組織生長因子的免疫組化研究

病理性瘢痕是臨床上的常見病、多發病，發病機制尚未完全明了。結締組織生長因子：connective51ssue growth factor，CTGF)是一種促纖維化生長因子，在病理情況下，CTGF的過度表達與某些增生性或纖維化性疾病的發生、發展密切相關，如硬皮病、腎纖維化、肝硬化、肺纖維化等。本實驗旨在通過應用免疫組化(SABC法)染色，圖像分析等方法，觀察CTGF在病理性瘢痕中表達的差異性，以探討兩者之間的內在關系。

1 材料和方法

1．1 標本來源及實驗分組：全部瘢痕疙瘩病例均屬于增生期。病例入選標準還包括：2年內未接受藥物注射、放射或外科治療；1個月內未予任何外用藥治療；無系統疾病者；無局部皮膚病變。標本均來源于本科。全部共75例，其中男33例，女42例：年齡12～63歲，平均(34±13)歲；病程1～20年，平均(8.28±7.05)年。對照組15例正常人皮膚均取自健康個體軀干上部。其中男6例，女9例：年齡12～53歲，平均(30±13)歲。實驗分8組：NS組(正常皮膚組)、SS組(淺表性瘢痕組)、HSS組(增生性瘢痕邊緣組)、HSM組(增生性瘢痕中間組)、HSN組(增生性瘢痕邊緣外正常皮膚組)和KS組(瘢痕疙瘩邊緣組)、KM組(瘢痕疙瘩中間組)、KN組(瘢痕疙瘩邊緣外正常皮膚組)。所有標本切取后用PBS沖洗，修剪去皮下脂肪，經10％中性福爾馬林液固定，常規石蠟包埋，切片厚5μm，分別經HE和免疫組織化學染色。

1．2 主要試劑與儀器：兔抗人CTGF多克隆抗體、既用型SABC免疫組織化學染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。真彩醫學圖像分析儀為德國Leica公司MD－20型。

1．3 實驗方法

1．3．1 HE染色：按照常規方法進行。

1．3．2 免疫組織化學染色：采用SABC法，石蠟包埋標本、切片后，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；3％過氧化氫阻斷內源性過氧化酶；0.02mol／L檸檬酸微波修復；非免疫性動物血清封閉非特異性抗原；山羊抗人CTGF多克隆抗體稀釋度為1:100，4℃孵育過夜；按sP試劑盒說明加生物素標記的二抗，孵育30min后加標記過氧化酶的鏈霉親和素孵育30min：DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照。半數切片不經蘇木精復染，留作圖像分析，其余切片經蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片。同時取乳腺癌及結腸癌的標本做陽性對照。顯微鏡觀察。

1．3．3 形態計量學及圖像分析：免疫組化切片的染色陽性信號為棕黃色顆粒，陰性對照片無棕黃色著色。將免疫組化切片置于相同強度光線顯微鏡下，觀察表皮、真皮中棕黃色顆粒的表達數量及表達強度；并觀測其形態及其分布特征。8組病例分別進行上述觀察。每例隨機抽取1張CTGF染色切片用圖像分析系統分別進行檢測。在40倍物鏡下每張切片自表皮向真皮深層按系統抽樣法隨機抽取5個視野，測定棕黃色陽性顆粒的總面積及平均光密度值，然后計算出單位面積的面密度值。

1．3．4 統計學處理：用SAS8.0統計軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(x±s)表示，樣本兩兩比較用q檢驗對數據進行統計分析，判斷均數差異顯著性，以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2．1 HE染色：觀察結果基本與文獻報道相同。

2．2 免疫組織化學染色：陽性信號主要定位于細胞漿，空白對照片無棕黃色著色。KS組織中CTGF表達陽性細胞數最多，可見大量彌漫性分布的成纖維細胞，著色較深，排列紊亂，極性消失，主要分布于真皮層膠原結節處，大部分呈強陽性著色，特別是真皮深層；表皮基底層也有少量陽性細胞，著色較淡。并且在瘢痕組織的邊緣，CTGF表達呈現由強變弱的過渡現象。在KN組織中也有較強的表達。在HS組織，陽性細胞分布與KS相同，但數量少，著色較淡。主要集中于中間部。而在HN組織中的表達極微弱。SS和NS組織中僅有極微弱的CTGF陽性著色，主要在表皮基底層。

2．3 圖像分析：各組CTGF陽性顆粒面密度值見表1；平均光密度值見表2。

3 討論

3．1 CTGF是1991年Bradham等通過應用抗血小板源生長因子抗體篩選人類臍靜脈內皮細胞eDNA文庫基因表達時首次發現。它主要由皮膚成纖維細胞、腎小球系膜細胞、肝星狀細胞、肺纖維連接蛋白、血管平滑肌細胞等間質細胞合成分泌。其作用主要表現為促進成纖維細胞增殖、介導細胞粘附、刺激細胞遷移、促進細胞存活、促進細胞外基質合成、促進細胞凋亡、促進新生血管形成、促進肉芽組織形成和纖維化、促進軟骨及骨骼發育等。它被視為轉化生長因子β(TGF－β)的下游反應元件，而TGF－β被認為是促進纖維化發展最重要的細胞因子，其在病理性瘢痕發病機制中所處的重要作用已被證實。在瘢痕形成過程的體內和體外實驗研究中，CTGF對成纖維細胞的分化增殖，具有很強的調控作用，而CTGF的異常高表達在瘢痕形成過程的發生、發展過程中起著關鍵作用，已成為瘢痕形成過程新的研究熱點。

3．2 本實驗通過逐組圖像分析，計算出能夠反映CTGF蛋白陽性表達率高低的面密度值(視野中被分析物體的總面積／視場面積)和反映CTGF蛋白陽性表達強度高低的平均光密度值(整個視野中每一點的光密度的疊加／點數的總和)，以便充分顯示各組中CTGF的表達差異。結果顯示CTGF主要表達于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織真皮層的成纖維細胞中，且兩者的陽性表達率及陽性表達強度均較正常皮膚和淺表性瘢痕中明顯增強，但又有瘢痕疙瘩強于增生性瘢痕的差異，說明增生性瘢痕和瘢痕疙瘩既有瘢痕增生的共同特性，又有增生程度及活性不同的差異。同時，發現瘢痕疙瘩外一定范圍的正常皮膚也有較強的表達，而與之外觀極其相似的增生性瘢痕外正常皮膚表達與正常皮膚無明顯差別，這預示瘢痕疙瘩具有侵襲正常皮膚的特性，而增生性瘢痕則無侵襲性。實驗結果與增生性瘢痕的預后及治療效果明顯好于瘢痕疙瘩的臨床事實基本一致。結果說明CTGF在病理性瘢痕發病機制中可能起到了非常重要的作用，或者說參與了病理性瘢痕的形成。

3．3 TGF－β除能誘導細胞增殖和促進組織纖維化外，尚有抗炎和抗細胞分化等功能，由于其作用的靶細胞種類繁多、生物學效應復雜，因此，完全阻斷其表達或活性，可能引起細胞生長失控、免疫失調、嚴重炎癥等不良反應。而CTGF作為TGF－β的下游介質，生物學效應較單一，可能僅介導TGE－β的促纖維化效應，其作用范圍也主要局限于結締組織。通過阻斷CTGF可能減輕TGF－β誘導組織纖維化的效應，同時保留TGF－β有利的抗炎癥和抗腫瘤細胞增生的效應。可以認為，CTGF是一種特異性更強并且具有選擇性干預結締組織形成過程的細胞因子。因此，應用一些阻斷CTGF的表達或抑制其生物活性的物質，如抗CTGF中和抗體或CTGF反義分子等，選擇性地作用于CTCF靶位，有可能成為將來治療瘢痕疙瘩及其它纖維化疾病的更特異、更有效的方法。