ＲＮＡｉ的發(fā)展與應(yīng)用

摘 要:RNAi作為一種調(diào)控特定基因表達(dá)的手段，被稱為基因組的免疫現(xiàn)象，已成為最近生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一，其發(fā)現(xiàn)為疾病治療提供了全新的途徑，并給整個(gè)生物理論界帶來(lái)了巨大而深遠(yuǎn)的影響。簡(jiǎn)要介紹了其機(jī)制和應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：RNAi；RNA；基因組免疫現(xiàn)象；生物醫(yī)學(xué)

中圖分類號(hào)：R329.2+8文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2007）12-025-04

RNAi（RNAi interference）是指通過(guò)反義RNA與正鏈RNA形成雙鏈RNA特異性地抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的現(xiàn)象，它通過(guò)人為地引入與內(nèi)源靶基因具有同源序列的雙鏈RNA（有義RNA和反義RNA），從而誘導(dǎo)內(nèi)源靶基因的mRNA降解，達(dá)到阻止基因表達(dá)的目的 ^[1] 。人工合成的siRNA（small interfering RNA）是長(zhǎng)度為21～25 核苷酸大小的小RNA分子，可以與RISC共同發(fā)揮作用，使沉默復(fù)合物識(shí)別靶目標(biāo)。在生物體中導(dǎo)入dsRNA，可引起體內(nèi)同源基因特異性沉默，當(dāng)病毒RNA侵入細(xì)胞后，RNAi就是機(jī)體監(jiān)視系統(tǒng)的成員，可檢測(cè)病毒信息，降解病毒核酸和蛋白，維持宿主基因組的穩(wěn)定性，保護(hù)機(jī)體不受病毒侵犯^[2] 。自從1998年Fire等^[3]提出siRNA以來(lái)，幾年間人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用速度是驚人的。RNAi現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其分子生物學(xué)機(jī)制和功能的深入研究，為成功地應(yīng)用RNAi研究與治療病毒感染、免疫缺陷疾病和腫瘤等重大疾病提供了理論基礎(chǔ)。^[4]

1 歷史

1993年報(bào)道， 將產(chǎn)生紫色素的基因轉(zhuǎn)入開(kāi)紫花的矮牽牛中，希望使紫色加深，可是，非但沒(méi)有加深紫色，反而成了白色。當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是矮牽牛本來(lái)有的紫色素基因和轉(zhuǎn)入的外來(lái)紫色素基因都失去了功能，稱為“共抑制”。1995年，康奈爾大學(xué)Su Guo博士在用反義RNA阻斷線蟲基因表達(dá)的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，反義RNA和正義RNA都阻斷了基因表達(dá)，他們對(duì)這個(gè)結(jié)果百思不得其解^[5]。1998年，Andrew Fire研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達(dá)的試驗(yàn)中，真正起作用的是雙鏈RNA，這些雙鏈RNA是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時(shí)生成的，于是提出了RNAi這個(gè)詞。2002 年，Zer2nicka -Coetz 等首次在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)RNAi^[6]。同年，Judy Lieberman 和Premlata Shankar 報(bào)道了在動(dòng)物中利用RNAi 技術(shù)治療疾病的研究進(jìn)展^[7]。研究發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)共抑制現(xiàn)象的植物中有一類25 nt的RNA ;加入果蠅胚胎溶解物的dsRNA 會(huì)斷裂為21～25 nt 的片斷;內(nèi)源性mRNA 在與導(dǎo)入dsRNA 的結(jié)合部位也被切割成21 ～ 25 nt 的片斷， 為RNAi 機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子， 命名為siRNA (small interfering RNA) ^{[8 ， 9 ]}。

2 生物進(jìn)化

許多真核生物中都發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象，而在原核生物中卻未發(fā)現(xiàn)，提示了RNAi的進(jìn)化地位，但是其在進(jìn)化中是如何出現(xiàn)，如何保存下來(lái)，在生物體中的意義有多大，目前均沒(méi)有明確，還需要更多研究來(lái)闡明。 ^[5]

3 重要意義

RNAi 受到追捧的原因主要有兩方面：①RNAi 可以說(shuō)是基因功能檢驗(yàn)的試金石，利用 RNAi 技術(shù)可以縮短對(duì)人類基因功能了解和認(rèn)識(shí)的時(shí)間，在不久的將來(lái)有望將人類大部分基因的功能和作用全部弄清楚；②科研人員有望利用這種技術(shù)獲得使致病基因失活的新型基因藥物，而基因藥物一直是生物技術(shù)界追捧的對(duì)象。^[10]

4 RNAi 作用機(jī)制與特點(diǎn)

4.1 機(jī)制模型^[11-14]

RNAi 發(fā)生過(guò)程大致為3階段:①起始階段。dsRNA在細(xì)胞內(nèi)Dicer均勻切割成21~23nt大小siRNA。dsRNA 可以是外源的，也可以是內(nèi)源的。siRNA長(zhǎng)短是種族特異的，5′端是磷酸的，3′端往往突出2 個(gè)nt。②擴(kuò)增階段。siRNA 與mRNA 靶向性結(jié)合，并作為引物，在RdRp 作用下再次形成dsRNA ，dsRNA 又被Dicer切割成siRNA ，新形成的siRNA 又可以進(jìn)入下一輪循環(huán)而達(dá)到擴(kuò)增目的。③效應(yīng)階段。 siRNA 和內(nèi)切核酸以及其它蛋白一起形成RISC (RNA-induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到靶向性作用，蛋白部分則起到降解mRNA 的作用^[15] 。

4.2 作用特點(diǎn)

(1)21～23 nt dsRNA 為降解靶基因的中介分子。 Phillip 等發(fā)現(xiàn)，501bpPr-dsRNA、505bpPr-dsRNA 在胚胎裂解物中孵育時(shí)，約15 %生成了穩(wěn)定存在的21～23 nt RNA 片段，而且不要求有相應(yīng)的mRNA 存在， 這證實(shí)了小片段RNA 由長(zhǎng)dsRNA 切割而來(lái)，而不是dsRNA 針對(duì)的靶基因mRNA 的產(chǎn)物。進(jìn)一步研究表明，21～23nt dsRNA7 為降解靶基因的介質(zhì)分子，決定切割位置。

(2) 細(xì)胞RNAi 裝置具有飽和性。Susan 等發(fā)現(xiàn)，RNAi 反應(yīng)中特異性dsRNA 到達(dá)一定濃度后不可再增加，而非特異性dsRNA 濃度可以改變。研究還發(fā)現(xiàn)，隨著非特異性dsRNA 濃度增加，特異阻抑反應(yīng)逐漸減弱。

(3) RNAi 作用廣泛。Fire 等在新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，dsRNA 介導(dǎo)RNAi 不僅在導(dǎo)入部位產(chǎn)生阻抑效應(yīng)，而且可以跨越細(xì)胞界限彌散到其它腔道和組織，發(fā)揮阻抑作用。

(4) RNAi 需要ATP 參與。Phillip 等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ATP 水平由250μmol 降至10μmol 以下，加入外源性ATP ，針對(duì)靶基因的dsRNA 沒(méi)有阻抑基因的表達(dá)，因此證明在體外RNAi 是需要ATP 合成的，外源性ATP 不可取代。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在ATP 合成缺失的裂解物中不能發(fā)生RNAi 。

(5) RNAi 過(guò)程不需蛋白輔助。Phillip 等用環(huán)己亞胺等合成拮抗劑，發(fā)現(xiàn)RNAi 仍以正常效率作用，說(shuō)明RNAi 中不需合成蛋白輔助產(chǎn)生阻抑效應(yīng)。

(6) RNAi 作用的靶基因有一定的選擇性。Andrew 等發(fā)現(xiàn)，保守基因更易產(chǎn)生RNAi 效應(yīng)，

而且神經(jīng)元細(xì)胞較其它類型細(xì)胞對(duì)RNAi 不敏感。參與精子運(yùn)動(dòng)的基因也很少能夠發(fā)生RNAi 效應(yīng)。^[17] 

5 應(yīng)用進(jìn)展

5.1 腫瘤抑制中的進(jìn)展 

傳統(tǒng)技術(shù)誘導(dǎo)的單個(gè)癌基因的阻斷往往不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，也很難達(dá)到預(yù)期的治療效果，而利用siRNA干涉技術(shù)能異地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因過(guò)度表達(dá)，使基因保持靜寂或休眠狀態(tài)，且抑制效果互不干擾，從而有望達(dá)到抗腫瘤作用。

5.2 拯救病毒或創(chuàng)造新病毒 

根據(jù)一些病毒的已知核酸序列，采用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)可以構(gòu)建出“人為設(shè)計(jì)”

的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列為基因組的新型病毒，這給通過(guò)獲得高免疫原性的低致病力毒株來(lái)制造疫苗提供了全新的途徑。也可在生產(chǎn)疫苗時(shí)，將流行毒株與高產(chǎn)毒株進(jìn)行基因重配，得到同時(shí)具有高產(chǎn)特性和流行毒株抗原性的重組毒株，以提高疫苗產(chǎn)量。^[18]

5.3 凋亡輔因子研究中的應(yīng)用^[19]

人類flap 內(nèi)切核酸酶(FEN21) 涉及DNA 復(fù)制及修復(fù)，F(xiàn)EN21 在DNA 復(fù)制期間對(duì)于處理岡崎片段很重要，但是Parrish 發(fā)現(xiàn)，編碼線蟲FEN21 同系物的crn21 ，其蛋白產(chǎn)物作為CPS26PEndoG的輔因子，可以介導(dǎo)凋亡DNA 片段化，而且其對(duì)凋亡的正常進(jìn)行很重要^[20]。細(xì)胞死亡相關(guān)核酸酶(cell death2related nucleases ， CRN21) 定位于細(xì)胞核， 利用CPS26的內(nèi)切核酸酶活性、CRN21的5′2 3′外切核酸酶活性及其缺口依賴性、內(nèi)切核酸酶活性，CRN21 能結(jié)合并協(xié)同CPS26促進(jìn)DNA 逐步片段化。用RNAi 減少crn21 的活性則會(huì)引起死亡細(xì)胞表型，這些表型類似于缺乏CPS26PEndoG的突變體所展示的表型。研究者證實(shí)，CRN21 能生理性結(jié)合CPS26 ， 而CPS26PCRN21 蛋白相互作用也能在體外刺激蛋白核酸酶活性。這些結(jié)果表明，涉及DNA 復(fù)制和修復(fù)的CRN21 也能作為凋亡核酸酶CPS26 的輔因子。

5.4 基因治療

針對(duì)有害基因序列設(shè)計(jì)dsRNA ，將dsRNA 導(dǎo)入生物體內(nèi)，或讓dsRNA 在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，利用dsRNA 引發(fā)其同源內(nèi)源有害基因的mRNA 序列的降解，從而可達(dá)到抑制該有害基因表達(dá)的目的，包括各種人類疾病，特別是腫瘤^[21]和遺傳病的相關(guān)基因。Brummelkamp 等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將siRNA 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，特異性抑制了癌基因K RAS(V12) 的表達(dá)。Scherr 等以引起慢性髓性白血病和bcrabl 陽(yáng)性急性成淋巴細(xì)胞白血病的癌基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)了對(duì)應(yīng)siRNA ，并獲得了87 %的有效抑制率。Elbashir 等成功將Hela 細(xì)胞中編碼核有絲蛋白、核纖蛋白的基因同時(shí)敲除。Wilda 等用siRNA 抑制白血病BCRPABL 融合基因表達(dá)也取得了成功^[22]。Manus 等開(kāi)展了對(duì)T 細(xì)胞的CD4PCD8 同時(shí)敲除的實(shí)驗(yàn)^[21]。

5.5 自身免疫治療

國(guó)外有人用siRNA來(lái)考察對(duì)不同鼠急性肝衰竭模型的治療效果。他們?cè)谙俨《颈磉_(dá)的Fas配體介導(dǎo)的肝衰竭過(guò)程中，在不同時(shí)間點(diǎn)給鼠注射caspase8siRNA，以抑制caspase8基因在肝臟的表達(dá)，結(jié)果防止了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，保護(hù)了肝臟，減弱了Fas抗體或腺病毒表達(dá)的Fas配體誘導(dǎo)的急性肝衰竭，使鼠的存活率有很大改善，說(shuō)明siRNA有較大的希望用于治療患者的急性肝衰竭。另外，使用RNAi技術(shù)還可直接干擾Fas的表達(dá)，達(dá)到治療的目的。^[23]

6 不足

Fraser等在研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi不能作用于某些基因和細(xì)胞類型（如神經(jīng)元），一些低水平表達(dá)的基因的RNAi現(xiàn)象并不明顯，如果幾個(gè)基因有相同或者近似的序列，RNAi會(huì)同時(shí)作用于它們，這樣，所觀察到的表型就不能肯定是由哪些基因被干擾所產(chǎn)生的。在醫(yī)學(xué)上，RNAi主要用于抗RNA病毒感染，而對(duì)DNA病毒的嘗試很少，從RNAi作用機(jī)制來(lái)看，RNAi技術(shù)同樣可以用于DNA病毒的防治。另外，對(duì)RNAi的研究目前是在體外培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行的，離臨床運(yùn)用還有距離。^[25]

7 結(jié)論

siRNA與RNAi技術(shù)真正應(yīng)用于日常生活還為時(shí)尚早，需要科學(xué)家們進(jìn)一步廣泛深入、細(xì)致持久的研究。盡管如此，我們依然可以預(yù)測(cè)，與其它基因技術(shù)一樣， siRNA與RNAi技術(shù)將在不久的將來(lái)在基因治療和基因應(yīng)用中發(fā)揮極大作用，并將給整個(gè)生物理論界帶來(lái)巨大而深遠(yuǎn)的影響。^[5]

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