復(fù)宮寧治療大鼠子宮內(nèi)膜異位癥的實(shí)驗(yàn)研究

摘 要:目的：探討復(fù)方復(fù)宮寧對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜的抑制作用。方法：采用放免法檢測(cè)血清E2水平，采用HE染色和透射電鏡技術(shù)觀察復(fù)宮寧對(duì)異位內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果：復(fù)宮寧組中，異位內(nèi)膜體積顯著縮小（P<0.01），E2水平明顯下降（P<0.05）；異位內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，腺體減少；細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀排列松散，并見較多凋亡現(xiàn)象和間質(zhì)纖維化，而在位內(nèi)膜不受影響。結(jié)論：復(fù)宮寧對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)E2水平、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：復(fù)宮寧；子宮內(nèi)膜異位癥；實(shí)驗(yàn)研究；生殖內(nèi)分泌

中圖分類號(hào)：R711.71文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2007）12-036-03

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是婦科常見疑難病，近年來其發(fā)病率逐年增加，目前尚無根治方法。內(nèi)異癥的特征是內(nèi)膜組織在宮腔外種植和生長(zhǎng)，并刺激周圍組織產(chǎn)生炎癥、粘連、包塊、痛經(jīng)、不孕、月經(jīng)紊亂等典型臨床癥狀。復(fù)宮寧是老中醫(yī)治療內(nèi)異癥的經(jīng)驗(yàn)方，以溫腎、活血、祛瘀等中藥配伍，可抑制異位子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)，維護(hù)正常子宮內(nèi)膜的生理功能，且無激素類藥物的副作用。本研究旨在闡明其藥理作用，為臨床提供治療依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康雌性成熟大白鼠，體重130g～150g，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物和試劑

中藥方劑復(fù)宮寧主要含有巴戟天、淫羊藿、菟絲子、莪術(shù)、紅花、蒲黃、三棱、延胡索等成分，由江西中醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院中藥房提供，每1ml含生藥2g。丹那唑膠囊：上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：000602，每粒100mg，丹那唑膠囊內(nèi)容物與蒸餾水制備的混懸液，5mg/ mL。雌二醇(E2)放免藥盒：天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供。

1.3 主要儀器 

醫(yī)用超凈工作臺(tái)SZK型：蘇州空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)；HITACHI-600透射電子顯微鏡：日本日立公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 造模

除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠腹腔注射4％水合氯醛1mL/l00g麻醉，并參考Jones方法^[1]造模，于下腹部正中靠左上方做一長(zhǎng)約1.5cm的切口，挑出左側(cè)子宮角，結(jié)扎子宮系膜血管，切下左側(cè)子宮角長(zhǎng)約1cm，并行端端吻合術(shù)。在洛氏營(yíng)養(yǎng)液中，縱向切開摘取的子宮角，將子宮內(nèi)膜與肌層分離，并切取5mm×5mm的內(nèi)膜組織片段，令其表面上皮對(duì)著腹壁，縫于右側(cè)子宮系膜，分層縫合腹壁，其它注意事項(xiàng)按照常規(guī)手術(shù)進(jìn)行，剩余內(nèi)膜組織進(jìn)行組織學(xué)檢查，以證實(shí)植入物為子宮內(nèi)膜。二級(jí)環(huán)境常規(guī)飼養(yǎng)。造模30d后，每只大鼠在麻醉狀態(tài)下剖腹觀察移植內(nèi)膜生長(zhǎng)情況。移植成活標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見移植物增大，呈隆起的小泡狀，有些形成多房的囊腫，充滿黃色或清亮漿液，被結(jié)締組織覆蓋并有血管形成，部分移植物呈黃色或褐色小結(jié)。雙腳規(guī)測(cè)量移植物體積V1＝長(zhǎng)×寬×高，單位mm3，預(yù)實(shí)驗(yàn)已通過病理證實(shí)。

2.2 分組給藥

除正常對(duì)照組的5只外，將子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、復(fù)宮寧組和丹那唑組，每組10只，每組每日3ml等體積灌胃給藥一次。模型對(duì)照組：生理鹽水灌胃；丹那唑組：丹那唑100 mg/kg灌胃，相當(dāng)于人每日每公斤用藥量的10倍；復(fù)宮寧組：2mg/ml復(fù)宮寧灌胃。

2.3 檢測(cè)項(xiàng)目

灌胃30d后由股動(dòng)脈取血，離心(2000r/min)30 min，分離血清待檢。接著處死動(dòng)物，暴露移植物，雙腳規(guī)測(cè)量移植物體積V2＝長(zhǎng)×寬×高，單位mm3。剖取模型對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜及治療組的異位、在位內(nèi)膜組織，進(jìn)行4%甲醛固定和2.5%戊二醛固定備用。檢測(cè)步驟：①放射免疫法測(cè)定血清E2：按試劑盒測(cè)定步驟進(jìn)行操作；②制作組織石蠟標(biāo)準(zhǔn)切片(厚3μm)待HE染色觀察；③透射電鏡觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13.0 for windows 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。數(shù)據(jù)以χ±s表示，各組用藥前后異位內(nèi)膜的差異采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 各組異位內(nèi)膜治療前后體積的比較

用藥前各組病灶體積無差異；用藥后，復(fù)宮寧與丹那唑?qū)Υ笫螽愇粌?nèi)膜均具有明顯的抑制作用。復(fù)宮寧組病灶明顯縮小（P<0．05），有顯著差異，與模型對(duì)照組病灶體積相比（P<0.01），有顯著差異。模型對(duì)照組自身前后比較，體積不但無縮小，卻繼續(xù)生長(zhǎng)（P<0.05），說明病變?cè)诎l(fā)展中。

3.2 對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清E₂的影響（見表2）

3.3 復(fù)宮寧對(duì)異位內(nèi)膜腺細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響?yīng)?/p>

光鏡下（圖1，2，3）可見，模型對(duì)照組異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞呈高柱狀或矮柱狀排列在囊泡的內(nèi)腔面，細(xì)胞核大，呈橢圓形位于基底部，胞漿豐富，細(xì)胞間連接較緊密。內(nèi)膜間質(zhì)豐富，其中有個(gè)別部位上皮層內(nèi)陷或疏松，有形成假腺體的特征，一些完整腺腔中還有分泌物存在，呈淡紅色。丹那唑組異位、正位內(nèi)膜腺上皮層明顯變薄，細(xì)胞呈矮柱狀甚至扁平狀松散排列，細(xì)胞核不規(guī)則，位置不定。復(fù)宮寧組異位內(nèi)膜腺上皮層明顯萎縮， 大部分腺上皮扁平狀，小部分呈低柱狀，固有腺體萎縮、減少或消失，由纖維組織所取代；而正位的子宮內(nèi)膜則無明顯影響，宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)細(xì)胞均無萎縮現(xiàn)象。透射電鏡顯示：復(fù)宮寧組與丹那唑組胞體收縮變圓，與鄰接細(xì)胞脫離；失去微絨毛，胞漿濃縮，核染色質(zhì)密度增高并凝聚于核膜周邊，核仁裂解；細(xì)胞膜內(nèi)陷和凋亡小體形成。

4 討論

內(nèi)異癥是雌激素依賴性的具有惡性腫瘤種植、生長(zhǎng)特性的良性病變。異位內(nèi)膜的凋亡、減弱并伴隨顯著的血清E2升高，導(dǎo)致含有更多存活細(xì)胞的經(jīng)血碎片逆流至腹腔種植后旺盛生長(zhǎng)。復(fù)宮寧能誘導(dǎo)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，與丹那唑療效相似，其調(diào)控機(jī)制很可能與E2水平下降密切相關(guān)。但復(fù)宮寧降低E2的作用不及丹那唑，可能因此而具有保護(hù)正常子宮內(nèi)膜的作用。Barbieri^[2]的“雌激素閾值”學(xué)說認(rèn)為，E2在一定范圍內(nèi)治療效果良好，當(dāng)控制E2處于閾值時(shí)可消退異位病灶又能使E2水平過低產(chǎn)生的副作用降至最低。本實(shí)驗(yàn)體現(xiàn)了中醫(yī)中藥調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌的優(yōu)勢(shì)。

目前，激素性藥物和手術(shù)治療內(nèi)異癥都難以根治，且易復(fù)發(fā)，由于毒副作用大或損傷大而不為患者接受。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證實(shí)了復(fù)宮寧對(duì)異位內(nèi)膜生長(zhǎng)的抑制作用和對(duì)在位內(nèi)膜的保護(hù)作用，因此，復(fù)宮寧可能成為當(dāng)前治療內(nèi)異癥的有效藥物。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Jones R C．The effect of a luteinizing hormone releasing horone agonist levonorgestrel，danazol and ovoriectomy on experimentel endometrlosis in the rat［J］.Acta Endocrlnol，1984，106(2)：282.

［2］ Barbieri R L，Gordon A M C．Hormonal therapy of endometriosis： the estradiol target［J］.Fertil Steril，1994(56)：820-822.

Experimental Research of Fugongning in Treating Endometriosis Rats

Zhu Jinhua， Sun Haoxin

(Jiangxi university of traditional Chinese medicine，Nanchang 330004）

Abstract:Objective:To study the effect of Fugongning on ectopic endometrial tissue-inhibition in Endometriosis rat models.Methods:The content of E2 in serum were determined with radio-immunoassay， slices were subjected to HE staining and electroscope observation to reveal the lesions . Results:The ectopic endometrial tissue shrinked（P<0.01） and E2 in the serum were significantly lower than those of the model group（P<0.05）.Gland epithelium of ectopic endometrial tissue became thinner， the number of the glanduls decreased. ectopic endcmetrial cell was shot cylindrical even tabular with incompact arrangement ，more apoptosis phenomenon and stroma fibration.but eutopic endometria didn't surviv any infection. Conclusion:Fugongning can control the growth of ectopic endometrium distinctively by regularing E2 and promoting the apoptosis of ectopic endcmetrial cell.

Key words: Fugongning；Endometriosis；Experimental research；Endocrine