番木瓜雄性性別的ＲＡＰＤ和ＳＣＡＲ標(biāo)記

摘 要：利用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定番木瓜雄性性狀。在214條隨機(jī)引物中，用引物Z18擴(kuò)增得到1條雄性多態(tài)性片段，此片段存在于試驗(yàn)所用材料的所有雄株中而兩性株和雌株沒有，將其命名為Z18-1000。根據(jù)對(duì)該片段的序列分析結(jié)果重新設(shè)計(jì)了2對(duì)引物將RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化成了SCAR標(biāo)記，并命名為SD－1000。

關(guān)鍵詞：番木瓜；雄性性狀；RAPD；SCAR

中圖分類號(hào)：S667.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009－9980(2007)01－72－04

番木瓜(Caric papaya L)是三型亞雌雄異株果樹，其株性有雌株、雄株及兩性株3種類型，雌株和兩性株能結(jié)果，雄株一般不結(jié)果。按照Storey等關(guān)于番木瓜株性基因控制理論，番木瓜的株性由3個(gè)等位基因控制：M₁(雄性)、M₂(兩性)及m(雌性)。M₁和M₂為顯性，m為隱性。雄株及兩性株的基因型分別為M₁m和M₂m，雌性株的基因型為mm，基因型為M_．M₁、M₁M₂、M₂M₂合子均敗育。番木瓜通常采用實(shí)生繁殖，因而在育苗過程中出現(xiàn)一些“木瓜公”，即雄株。這不僅對(duì)生產(chǎn)造成浪費(fèi)，而且在有雄株的果園留種會(huì)使以后繁殖的幼苗出現(xiàn)大量的雄株，只有在6~8個(gè)月后番木瓜進(jìn)入開花結(jié)果期能從形態(tài)上準(zhǔn)確判斷植株性別時(shí)才能將雄株整株斬除。因此，在苗期鑒定出植株的性別，對(duì)番木瓜育種及栽培均具有重要的意義。有人試圖采用物理、化學(xué)和組織培養(yǎng)的方法預(yù)測(cè)植株的性別，結(jié)果均不理想。利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠克服形態(tài)和生理生化指標(biāo)受環(huán)境及發(fā)育階段影響的缺點(diǎn)，從分子水平上在苗期鑒定出植株的性別。Urasaki等使用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定番木瓜雄株、雌株和兩性株，得到一個(gè)存在于雄株和兩性株而雌株沒有的450bp條帶，并成功將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。Eliana等間用RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定番木瓜Solo系列性別時(shí)，獲得一個(gè)僅存于兩性株的438bp條帶。周國(guó)輝等得到2個(gè)大小分別為1050bp和1080bp的兩性株多態(tài)性RAPD條帶。而目前在我國(guó)尚未見有獲得雄性RAPD和SCAR標(biāo)記的報(bào)道。本研究參照相關(guān)的理論和方法采用RAPD和SCAR標(biāo)記技術(shù)從分子水平上鑒定番木瓜株性，旨在為生產(chǎn)上在苗期快速準(zhǔn)確地判斷并剔除雄株以及育種工作的早期選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 試材

供試品種為日升，種植于仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院教學(xué)農(nóng)場(chǎng)，為1年生植株，分單株采集已知性別植株幼嫩葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于84℃冰箱內(nèi)備用。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取及性別DNA池的構(gòu)建 采用TPS法抽提番木瓜植株DNA，提取步驟為：(1)取1g嫩葉研磨成粉末后倒入滅菌的2.0mL離心管中，加入800μL TPS提取緩沖液(含100mmoL/L Tris-HClpH 8.0，10mmoL/L EDTA pH 8.0，1moL/L KCl)在75℃中水浴40min；(2)13000r/min離心10min，取600μL上清液于1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，靜置12h；(3)13000r/min離心10min，棄上清，取沉淀；(4)加入800μL 70％的乙醇，13000r/min離心8min，棄上清，取沉淀；(5)將沉淀干燥后加入300μL 1×TE溶解。保存于4℃的冰箱備用。用UV-751型紫外分光光度計(jì)測(cè)定D_260nm/D_280nm值，判斷其純度，并采用Warburg-ehristian公式計(jì)算濃度；用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為0.8％瓊脂糖凝膠電泳的對(duì)照，驗(yàn)證DNA樣品的濃度并鑒定質(zhì)量。根據(jù)混合分離群體分析法(BSA)原理，分別等量混合10株兩性株、雌株、雄株DNA，構(gòu)成兩性、雌性、雄性DNA混合池。

1．2．2 RAPD分析 RAPD反應(yīng)參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。反應(yīng)總體積為25μL：10×buffer(含Mg²⁺25mmoL/L2.5μL，10堿基隨機(jī)引物(約5μmoL/L)1μL，Taq酶1.5U，10mmoL/L dN/P0.4μL，模板DNA 40～50ng，其余部分用ddH20補(bǔ)齊。擴(kuò)增反應(yīng)在THermo公司的P×2 Thermal Cycler型PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 1min，37℃ 2min，72℃ 1min，5個(gè)循環(huán)后改為94℃ 0.5min，37℃ 1min，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μgm/L EB)，0.5×TBE電解液中電泳，在紫外透射儀下觀察并照相保存。

1．2．3 特異片段的回收、克隆和測(cè)序以及SCAR標(biāo)記分析 將RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)，0.5×TBE電解液中電泳，然后在紫外燈下快速地將DNA特異片段從瓊脂糖凝膠上切割下來，并盡可能去除多余的瓊脂糖凝膠，將切割下來的膠塊裝入1.5mL離心管中。由北京鼎國(guó)生物工程公司協(xié)助克隆和測(cè)序。在Z18～1000片段兩端包括RAPD引物的10bp在內(nèi)再延長(zhǎng)8～12bp，設(shè)計(jì)了2對(duì)引物。利用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行SCAR擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25μL：10×buffer(含Mg²⁺25mmoL/L2.5μL，2種5μmoL/L特異引物各0.5μL，taq酶1.5U， 10mmoL/L dNTP0.4μL，模板DNA40～50ng，其余部分用ddH₂O補(bǔ)齊。擴(kuò)增反應(yīng)在Thermo公司的P×2 Thermal Cycler型PCR儀上按以下程序進(jìn)行：循環(huán)程序1:94℃ 1min，66℃ 2min，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)后改為94℃ 0.5min，66℃ 1min，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min；循環(huán)程序2:94℃ 1min，57℃ 2min，72℃ 1min，3個(gè)循環(huán)后改為94℃ 0.5min，57℃ 1min，72℃ 1.5min，35個(gè)循環(huán)后于72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)，0.5×TBE電解液中電泳，在紫外透射儀下觀察并照相保存。

2 結(jié)果與分析

2．1 番木瓜性別鑒定的RAPD標(biāo)記

以雌性、兩性、雄性DNA池為模板，共篩選了214條10堿基隨機(jī)引物(上海生工生物工程公司產(chǎn)品)，找到1條引物Z18(序列為5-GGGCTAGTCA-3’)能在雄性DNA池中產(chǎn)生1條1000 bp左右的特異性的擴(kuò)增帶，重復(fù)3次，結(jié)果均一致，隨機(jī)選取3種性別各5個(gè)單株DNA進(jìn)行驗(yàn)證，也獲得同樣結(jié)果(圖1)。將這一特異條帶命名為Z18-1000。

2．2 RAPD標(biāo)記ZlS-1000的克隆、測(cè)序結(jié)果與番木瓜性別鑒定的SCAR標(biāo)記

對(duì)以酶切及PCR鑒定為陽性克隆的外源插入片段進(jìn)行了序列分析。序列結(jié)果如圖2，在序列的兩端均有引物Z18的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證明了克隆片段的正確性。計(jì)算得知Z18-1000片段的實(shí)際堿基數(shù)為1001bp。該序列輸入NCBI(National CenterBioteehnology Information)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用BLASTn和FAS7A檢索未見同源序列。已將該序列提交至GenBank GSSs(Genome Survey Sequences)數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank接收號(hào)為：DQ787854。為了將RAPD標(biāo)記Z18-1000轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，根據(jù)序列分析結(jié)果。在原有引物Z18序列的基礎(chǔ)上向內(nèi)延長(zhǎng)8-12 bp設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)特異引物。第1對(duì)引物SRl：5’GGGCTAGTCAATGTGCTAATGG3’，22 bp；SR2：5’GGGCTAGTCATCACTATCGC3’，20 bp。第2對(duì)引物為SR3：5’GGGCTAGTCAATGTGCTA3’，18 bp；SR4：5’GGGCTAGTCATCACTATCG3’，19bp。4引物的Tm值分別為：60℃、60℃、55℃、57.5℃。比較55℃、57℃、60℃、62℃、64℃、66℃不同退火溫度，并反復(fù)試驗(yàn)表明利用第l對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)，在55℃、57℃、60℃、62℃、64℃的退火條件下，雌性、兩性、雄性DNA均能擴(kuò)增出Z18-1000片段，其中雄性DNA的條帶強(qiáng)度約是雌性和兩性的2～4倍。將退火溫度提高到66℃時(shí)，僅能在雄性DNA中擴(kuò)增出1000bp的特異片段(圖3)，因此，確定第1對(duì)引物的SCAR擴(kuò)增退火溫度為66℃，即利用第1對(duì)引物進(jìn)行SCAR擴(kuò)增時(shí)使用循環(huán)程序1。利用第2對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)，在退火溫度為57℃時(shí)僅能在雄性DNA中擴(kuò)增出1000 bp的特異片段(圖4)，故確定第2對(duì)引物的SCAR擴(kuò)增退火溫度為57℃，即利用第2對(duì)引物進(jìn)行SCAR擴(kuò)增時(shí)使用循環(huán)程序2。將兩對(duì)引物擴(kuò)增出的相同SCAR多態(tài)性片段統(tǒng)一命名為SD-1000。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，該標(biāo)記對(duì)反應(yīng)條件和體系如Mg2~、模板DNA和引物濃度等不敏

3 討 論

RAPD標(biāo)記技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、快速、DNA用量少，在農(nóng)、林、醫(yī)學(xué)及生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，但是該技術(shù)有利用單引物擴(kuò)增多個(gè)基因位點(diǎn)和對(duì)反應(yīng)條件敏感等不足之處，在一定程度上限制了RAPD標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展。將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記可以克服此限制。目前，已有很多RAPD標(biāo)記成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記的例子，但是也有一些研究存在將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記時(shí)多態(tài)性消失的現(xiàn)象。RAPD擴(kuò)增多態(tài)性可能是引物位點(diǎn)幾個(gè)核苷酸序列差異或擴(kuò)增片段序列內(nèi)結(jié)構(gòu)重排的結(jié)果，由引物結(jié)合區(qū)的序列差異導(dǎo)致的多態(tài)性片段進(jìn)行SCAR轉(zhuǎn)化時(shí)，在退火溫度不夠高、體系不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那闆r下，可能不表現(xiàn)多態(tài)性。根據(jù)相關(guān)研究表明，解決SCAR轉(zhuǎn)化時(shí)多態(tài)性消失的方案主要有：(1)適當(dāng)縮短引物的長(zhǎng)度。Vidal等提出根據(jù)測(cè)序結(jié)果在10堿基隨機(jī)引物的3’端只增加4～8個(gè)堿基，可檢測(cè)到原有的多態(tài)性，同時(shí)提高了擴(kuò)增的穩(wěn)定性。(2)適當(dāng)提高擴(kuò)增時(shí)的退火溫度。(3)對(duì)于兩等位基因間單堿基的差異，可利用核酸酶裂解和變性梯度凝膠電泳等方法鑒別。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)驗(yàn)證了適當(dāng)提高擴(kuò)增時(shí)的退火溫度和縮短引物長(zhǎng)度這2種成功轉(zhuǎn)化RAPD標(biāo)記為SCAR標(biāo)記的比較有效的方法。

應(yīng)用上述所獲得的RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記在34株已知性別的番木瓜植株上驗(yàn)證，結(jié)果表明Z18-1000和SD-1000這2種標(biāo)記均只在雄株出現(xiàn)，雌株和兩性株沒有，說明2種方法可以比較可靠地從早期幼苗中鑒定出雄株。從2種標(biāo)記的特點(diǎn)來看，SCAR標(biāo)記更加穩(wěn)定、可靠。本試驗(yàn)所獲得的SCAR標(biāo)記SD-1000僅存在于雄株DNA中，而兩性株和雌株沒有條帶，所以在利用SCAR標(biāo)記鑒定性別時(shí)，可以在PCR產(chǎn)物中直接加入EB，然后在紫外燈下觀察有無熒光反應(yīng)來判斷PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)可隨機(jī)抽取部分PCR擴(kuò)增反應(yīng)呈陽性的產(chǎn)物進(jìn)行電泳來檢驗(yàn)快速判斷的正確性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可以用此簡(jiǎn)化方法對(duì)幼苗性別進(jìn)行大規(guī)模鑒定，既快速簡(jiǎn)便，又大大降低成本。

作者簡(jiǎn)介：任朝興，男，在讀碩士生，從事果樹生物技術(shù)研究。